[发明专利]棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物

权利要求书

1.一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于， 具体步骤包括如下：

①棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取；

②引物设计与筛选；

③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；

④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单一PCR扩增特异性验证；

⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；

⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证；

⑦按照建立的多重PCR方法对临床虫种鉴定方法进行可行性验证。

2.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方 法，其特征在于，步骤①中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA 提取方法为：从70％乙醇保存液中取出单个标准虫种，采用DNA提取试剂盒提取棘颚口线虫、 日本颚口线虫、杜氏颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方 法，其特征在于，步骤②中所述的引物设计与筛选具体为：应用分子生物学软件对颚口属线 虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、 日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引 物，一对引物只能扩增出相应虫种的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、 互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：

棘颚口线虫的特异性引物：

GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’(SEQ ID NO.1)；

GS4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO.2)；

杜氏颚口线虫的特异性引物：

GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’(SEQ ID NO.3)；

GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’(SEQ ID NO.4)；

日本颚口线虫的特异性引物：

GN1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’(SEQ ID NO.5)；

GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’(SEQ ID NO.6)。

4.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方 法，其特征在于，步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应 体系，体系包含25mmol/L Mg²⁺2.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 1μL， 5U/μL Taq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L，根据多重PCR 条带的明亮，适当调整步骤②的引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、 53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验，最后确定最佳的多重PCR模式。

5.根据权利要求1或4所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检 测方法，其特征在于，步骤③的最佳多重PCR模式具体为：最佳多重PCR反应体系：25μL 反应体系中10×buffer 2.5μL，Mg²⁺2.5μL，dNTP 1μL，杜氏颚口线虫与日本颚口线 虫上下游引物各0.3μL，棘颚口线虫上下游引物各0.4μL；Taq聚合酶0.1μL，模板DNA 各1μL，加灭菌双蒸水至25μL；最佳的多重PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，55 ℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。