[发明专利]叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基因检测技术领域，尤其涉及一种叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

叶酸是一种B族维生素，人体本身不能合成。从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下，还原为四氢叶酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应，是机体细胞生长和分裂所必需的物质，也是人体内参与合成碱基的关键辅助因子。因此，缺乏叶酸，胎儿、婴幼儿会出现发育缺陷和迟缓。在孕妇中大力推广“叶酸强化”，从某种程度上减少了出生缺陷。孕妇一般采用每天服用一粒叶酸片(400微克)的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个用量是充足的，但对于叶酸利用能力不足的孕妇却远远不够。此外，最近发现“叶酸强化”还存在一定负面效应，大范围人群大量补充叶酸，人为地造成未来的人口对于大量维生素产生依赖性，由此，可能导致人口整体的基因组成发生变化，这种人群对于某些致命的疾病将变得十分脆弱。因此，鉴别出叶酸利用能力正常和叶酸利用能力不足的人群，个性化合理的补充叶酸具有重要的现实意义和长远意义。

部分叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶基因发生了突变，导致了酶分子一个氨基酸的替换，使酶活性大大下降而影响叶酸的利用能力。已经报道叶酸代谢途径中一些酶基因的多态性与神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病等疾病相关联。

在叶酸利用能力相关的基因检测技术临床应用之前，妇产科医师通常只能建议所有孕妇按照标准量、标准时间来服用叶酸。我们提出个体化合理使用叶酸，为此研发了本试剂盒，通过本试剂盒检测，可检测出影响叶酸代谢和利用能力的一些已知的常见的突变，将亚健康人群分为疾病风险高、中、低三个亚群，指导这些人群个性化使用叶酸，对高风险人群进行特异性个性化干预。有针对性的合理补充叶酸，可以消除过度“叶酸强化”带来的负面影响。

本试剂盒以我国常见的叶酸不足引发的疾病(神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病)为代表性目标疾病，对于阻止亚健康向疾病转变以及促进健康恢复起到一定作用，为我国出生缺陷的降低将起到一定作用。

此外，肿瘤生长过程中需要大量合成DNA，由于叶酸对DNA的加工很重要，因此叶酸代谢途径也被作为抗肿瘤治疗的靶点。一个叫甲氨喋呤的化合物就是叶酸的类似物，它可抑制叶酸的代谢，目前仍是临床上多种肿瘤的化疗药物，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、肝癌、顽固性普通牛皮癣及自身免疫病等。这类化疗药物对叶酸代谢正常的患者疗效较为明显。因此在使用针对叶酸代谢的抗肿瘤药物之前，也可通过本试剂盒检测，筛选出存在叶酸利用能力低下风险的个体，指导临床医生合理选择抗肿瘤药物。

目前，传统基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC)、直接测序、基因芯片等。这些方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，除基因芯片外，这些方法难以针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。而基因芯片技术平台成本昂贵，对环境和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关酶基因突变筛查方法，以实现临床快速检测和规模化筛查。

我们研发的试剂盒在临床应用上具有明显的优势。传统的基因检测技术中每个位点都要单独检测，大大浪费了检测的时间、试剂、人力和物力，效率低。使用本试剂盒检测，在一个反应管中可以同时对16个位点进行检测，最终给出16个位点的基因分型结果。

我们开发的利用SNaPshot技术检测叶酸利用能力相关酶基因的技术平台，其原理是：多重PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸。然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以检测单核苷酸的突变。延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型；延伸引物的片段长度决定峰的位置；延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。

发明内容：