[发明专利]叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于叶酸利用能力基因检测试剂盒包含：

(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；

(2)按一定比例混合的16对PCR引物混合物；

(3)按一定比例混合的16条延伸引物混合物；

(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；

(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；

(6)使用说明书。

2.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于它的检测方法为：使用Primer 5、Gene runner和MassARRAY Assay Design引物设计软件协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的16个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的16条延伸引物，对16个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。

3.根据权利要求1所述的叶酸利用能力基因检测试剂盒及检测方法，其特征在于所述的试剂盒包含检测CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del19、FOLH1基因T1561C、GST01基因C428T、MTHFD1基因G878A、MTHFD基因G1958A、MTHFR基因A1298C、MTHFD基因C677T、MTR基因A2756G、MTRR基因A66G、NAT1基因C1095A、NFE2L2基因ins1+C11108T、RFC1基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六个基因突变位点的引物：

第一组：所述检测CBS基因C699T位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P1-F：TTTCTATGCAGTACCGCAACG；

P1-R：AATCAAGATGGACAGAGGGAC；

延伸引物：E1：(T)₂₂AGCAACCCCCTGGCTCACTA；

第二组：所述检测DHFR基因c594+59del19位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P2-F：ACTGCATCGTCGCTGTGTC；

P2-R：CGGGCAGAAATCAGCAAC；

延伸引物：E2：(T)₃₄AGGCTGCCCACGGTCGGGGT；

第三组：所述检测FOLH1基因T1561C位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P3-F：TCCAACTTCAGAAACCTT；

P3-R：TTAGTATACCGTGCTCTGC；

延伸引物：E3：(T)₃₄GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT；

第四组：所述检测GST01基因C428T位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P4-F：ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC；

P4-R：CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC；

延伸引物：E4：(T)₂₉CCAAAATAAAGAAGACTATG；

第五组：所述检测MTHFD1基因G878A位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P5-F：GCTTGAAACTGAGGTGAG；

P5-R：AGGTTGTTATACTGAATCATCC；

延伸引物：E5：(T)₄CACAGTAGAGAGTGCCAAGC；

第六组：所述检测MTHFD基因G1958A位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P6-F：GTTTGCCAACATCGCACATG；

P6-R：CTAACCTACAAACCCTTCTGG；

延伸引物：E6：(T)₁₂CCTCCATCATTGCAGACC；

第七组：所述检测MTHFR基因A1298C位点突变的引物的碱基序列为：扩增引物：P7-F：CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC；

P7-R：TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC；

延伸引物：E7：(T)₃₁GGAGGAGCTGACCAGTGAAG；

第八组：所述检测MTHFD基因C677T位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P8-F：TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG；

P8-R：CCTTCACAAAGCGGAAGAATG；

延伸引物：E8：(T)₁₂GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；

第九组：所述检测MTR基因A2756G位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P9-F：CATTGACCATTACTACACCAG；

P9-R：TCTGTTTCTACCACTTACCTTG；

延伸引物：E9：ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG；

第十组：所述检测MTRR基因A66G位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P10-F：TATATGCTACACAGCAGGGAC；

P10-R：GGCTCTAACCTTATCGGATTC；

延伸引物：E10：(T)₂₀AAGGCCATCGCAGAAGAAAT；

第十一组：所述检测NAT1基因C1095A位点突变的引物的碱基序

列为：扩增引物：P11-F：CTAGACATCAAATCATTTCACC；

P11-R：CTTTCTAGCATAAATCACCAAT；

延伸引物：E11：TAACCACAGGCCATCTTTAAAA；

第十二组：所述检测NFE2L2基因ins1+C11108T位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P12-F：AACTGACTGAGCAACTATTACG；

P12-R：ATTGCTCCTCTGTGTCTCC；

延伸引物：E12：(T)₁₄CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG；

第十三组：所述检测RFC1基因G80A位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P13-F：CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG；

P13-R：AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA；

延伸引物：E13：(T)₂₅CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC；

第十四组：所述检测SHMT1基因C1420T位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P14-F：GTTCAAGGAGAGACTGGC；

P14-R：GCTCATCCATCTCTCAGG；

延伸引物：E14：(T)₇AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT；

第十五组：所述检测TCN2基因C776G位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P15-F：TCCTCACTCTATCACCAGTTC；

P15-R：TCATGAGAGCATTCTGGAAGG；

延伸引物：E15：(T)₃₈CCTCATGACTTCCCCCATGC；

第十六组：所述检测TYMS基因1494del6位点突变的引物的碱基序列为：

扩增引物：P16-F：AGGAACTGAGCAGATAAGTGG；

P16-R：CGATCATGATGTAGAGTGTGG；

延伸引物：E16：(T)₄₀GAGTGTGGTTATGAACTTTA。