[发明专利]高通量检测脊椎动物病原体基因芯片的探针设计方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物芯片探针的一种设计方法。尤其是基于此方法设计得到的探针用来对以脊椎动物为宿主的病毒、细菌、真菌、原生动物进行高通量检测，本发明对不同类型的病原体分别采用了有针对性的设计流程。

背景技术

传染病是由各种病原体引起的能在人与人、动物与动物或人与动物之间相互传播的一类疾病。每种传染病都有其特异的病原体，包括病毒、细菌、真菌、原虫、螺旋体、立克茨体等。传染病与其他种类疾病相比，具有发病强度高、传播速度快、波及范围广、地域性和季节性强等特点，传染病产生的危害性极大，不但患者死亡率高，而且容易导致社会恐慌心理，产生的次级危害往往更大，直接影响社会的经济活动和人的正常生活秩序。

虽然传染病理论上分为人与人、动物与动物或人与动物专有传染病，但是许多传染性疾病，甚至包括流行病，都起于人畜共通的特性，要区分哪些疾病从感染动物逐步演化成可以感染人类并不简单，但有证据显示麻疹、天花、流行性感冒、白喉等皆是如此。而艾滋病、感冒和结核也都来自人类以外的物种。人畜通病在国际间引起密切关注，因为它们通常是过去未被发现的疾病，或是毒力在演化过程中增强，或偶然传入不具对抗该疾病之免疫力的族群或物种。因此，对以脊椎动物为宿主的病原体进行系统地监测，是有效进行传染病防控的一个必要环节。

在传染病爆发过程中，人类由以前被动承受，到治疗控制，再到提前预防控制，积累了大量和传染病做斗争的技术经验。特别是随着现代医学和分子生物学技术发展，人类已经建立起了多种具体传染病检测方法，1)微生物培养法；2)血清学标记物检测法；3)血液或分泌物中所含病毒和病原相关蛋白质检测，其中包括ELISA、胶体金等方法；4)通过传染源核酸序列，进行特异性的荧光定量PCR检测法；5)快速发展的生物芯片微阵列高通量方法。

微生物培养法由于直观方便等特点，还是最主要的传染病诊断工具，但有些传染原如病毒和钩端螺旋体无法进行人工培养，就只能借助其他诊断工具；血清学标记物检测法，也是通过病原体感染机体后产生的特异性抗体进行检测，通行的抗体检测由于存在“血清学窗口期”，只能在感染2-4周后才能确诊，而且该方法还需要和微生物培养法相互引证；基于血液或分泌物的病原蛋白质检测，如ELISA和胶体金法也是对血清学检测方法的改进，也同样存在以上弊端；新近涌现的针对病原体的RNA或DNA的荧光定量PCR检测方法，有灵敏性高，准确率高，能够有效缩短“病原窗口期”等特点。但该检测方法也只能针对已知病原体设计特异的PCR引物和探针，不能实现高通量检验检测，不能满足新发与突发性传染病的快速、准确、灵敏的诊断需求，是重大传染性疾病的防疫防控与及时救治的主要技术瓶颈之一。

生物芯片方法，在考虑了传统和现有传染病检测方法的局限性基础之上，结合现代分子生物学高通量技术优势，而建立起来的传染病病原体诊断检测方法。该方法主要技术优点包括：1)高通量。一张芯片上的一个点阵可以对一份样本同时分析成千上万种的病原体，而一张芯片上有可以同时分析数十个临床样本；2)快速、准确和灵敏。单次检测1天即可完成，加之高通量特异性，检测效力明显优于现有的其他方法；由于检测过程中采用全封闭的荧光自动化检测系统，集合特异性探针，检测准确度高、灵敏度好；3)可检测未知病原体。现有病原体检测方法，只能对已知病原体进行确认，对于未知病原体检测则无能为力，例如荧光定量PCR方法，有很多技术优势，但前提必须知道被检病原体核酸序列，否则将无法检测。而生物芯片检测系统，由于探针设计本身就具有兼容性，检测序列发生突变将不会影响杂交检测。大部分病原体新品种其实都是已知病原体在药物和环境压力下的突变体，序列具有很高同源性。

由于生物芯片检测技术本身技术优点和临床应用的潜在价值，使得国内外众多科技专家专注于生物芯片检测技术在传染病学中的研究。例如，美国加州大学旧金山分校DeRisi实验室研发的能检测多种病毒的Virochip芯片，美国哥伦比亚大学Lipkin实验室研发的能同时检测多种病毒、细菌、真菌和寄生虫的GreeneChip芯片等。