[发明专利]玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增(LAMP)快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

玉米细菌萎蔫病又称玉米细菌性叶枯病、斯氏细菌枯萎病、斯氏叶枯病、玉米欧氏菌萎蔫病等，属全株系统性维管束病害。玉米细菌萎蔫病最初的症状是萎蔫，叶片现灰绿色至黄色线状条斑，有不规则形或波浪形的边缘，与叶脉平行，严重的可延伸到全叶。这些条斑迅速变黄褐干枯，在近地面处茎的髓部变为中空。细菌通过维管束扩展，有时从维管束切口处流出黄色细菌脓液。有的还能进入籽粒。受害株变矮或雄花过早变白死亡。广泛分布在美国加拿大、墨西哥、巴西、秘鲁、圭亚那、意大利、波兰、罗马尼亚、南斯拉夫、泰国、越南马来西亚等，是中国重要外检对象。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米细菌性萎蔫病菌环介导恒温扩增快速检测试剂盒及使用方法。

本发明的另一目的是提供一种玉米细菌性萎蔫病菌生物检测方法，以克服现有技术的不足，从而为生物安全提供科学的依据和指导作用。

本发明提供的玉米细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括：

(1)模板预处理反应液：3.2μM 引物FIP，3.2μM 引物BIP，0.4μM 引物F3，0.4μM 引物B3，800μM dNTP，1×Thermol Buffer，和ddH₂O。引物FIP、BIP、F3与B3的终浓度比为：8∶8∶1∶1。

所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别如SEQ ID NO：1、2、3和4所示。

(2)溶液Ⅰ：1×Thermol Buffer，0.64U/μL Bst DNA Polymerase，和ddH₂O。

所述1×Thermol Buffer成分为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.01％Triton X-100，和ddH₂O，pH 8.8。

本发明提供的利用上述试剂盒检测玉米细菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步骤：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA于94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个循环，产物用于LAMP模板。

(3)LAMP恒温扩增：

将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μL加入25μL溶液I中，63℃加热60min，80℃10min，降温至4℃。

(4)核酸凝胶电泳检测。

核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现条带可以判断为阳性，否则为阴性。

本发明的试剂盒根据玉米细菌性萎蔫病菌菌株的核糖核酸聚合酶β亚基基因rpoB保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的LAMP扩增技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特异性强、灵敏度高，特别适用于基层植保机构及植物产品公司与相关检测部门。

附图说明

图1玉米细菌性萎蔫病菌LAMP扩增图谱，其中：1-5 样品 6 阳性对照 7 DNA Marker 8 阴性对照

具体实施方式

本发明的主要原理为：LAMP引物的设计主要是针对靶基因的四个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和F1c区以及5’端的B1、B2和B3区等4个不同的位点设计4种引物。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

本发明提供的玉米细菌性萎蔫病菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其中包括：