[发明专利]一种培养胰腺干/祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的培养方法，尤其是一种高效诱导胰腺干/祖细胞 分化为内分泌细胞的培养方法。

背景技术

组织细胞培养是生物学中最为重要的实验技术，应用极为广泛，促进着 众多前沿科学如分子生物学、基因工程、蛋白质工程等的发展。组织细胞培 养的方式主要分为三类：悬滴培养、单层培养和立体培养。

悬滴培养法：20世纪初由Harrison和Carrel创立单盖片悬滴培养法，1924 年Maximow改良为双盖片悬滴培养法。悬滴培养的优点是细胞生长在近似 于立体的环境中，缺陷是细胞生长的空间狭小、气体不足和营养成分少， 限制细胞的生长。

单层培养法：从20世纪40年代末期开始，由Dulbecco为首的学者们，改 用人工合成培养基加胎牛血清作为培养液和把细胞接种在培养瓶中培养，能 使细胞生长为单层，而成为单层培养。单层培养具有传代方便、易于应用各 种方法观察和进行研究，以至成为世界至今仍普遍应用的经典培养方法。单 层培养的细胞只有长和宽二维结构，失去了原体内时的立体形态，致使细胞 不能充分表达相应基因产物和发生分化。

立体培养法：目前，立体培养尚在完善和发展中。这种方法的优点为： 将细胞培养在特殊容器中，能随时更新培养液、提供营养物质和排除代谢产 物；为培养细胞提供有与体内相似的支架系统，建成与原体内相似的生存环 境；为培养细胞提供特定促细胞增殖生长和分化因子。

2007年，我国糖尿病的发病率已增加至5％，糖尿病及其并发症的死亡率 已上升至第三位。随着胰岛移植技术的发展，胰岛移植成为彻底治疗糖尿病 最有希望的方法。但是，供体胰腺的不足限制了胰岛移植的广泛开展，因此， 迫切需要寻找β细胞的新来源。胰腺干/祖细胞可分化为β细胞，因此胰腺 干/祖细胞的分离、培养和诱导分化将为细胞治疗糖尿病提供了基础。目前， 胰腺干/祖细胞仍缺乏特异的表面标志，研究者正在尝试寻找。应用特异的 表面标志，流式细胞仪或免疫磁珠分选可以简单，有效地分离胰腺干/祖细 胞。但是，分离胰腺干/祖细胞后面临的最大困难是得到的细胞数比较少， 大部分研究者采用常规的培养方法如单层培养或三维培养，诱导其分化为β 细胞的效率低，而且需要大量细胞因子的诱导。

发明内容

为了解决现有胰腺干/祖细胞培养技术中存在的效率低、细胞因子诱导剂 量大、诱导后的β细胞数量少功能低下等缺陷，本发明提供了一种解决方案， 将悬滴培养法和立体培养法相结合并改进，建立了一种培养胰腺干/祖细胞 的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种培养胰腺干/ 祖细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将胰腺干/祖细胞接种于微孔培养板中，接种结束后，立即快速将 接种板翻转，使接种的细胞悬液和培养液的混合物在接种板表面形成吸附于 接种板的向下的悬滴，而不至于导致液体滴落或溅出；

(2)在悬滴状态下培养至细胞形成细胞球之后，将细胞球转移至漂浮的 培养膜上继续培养至形成具有生理学功能的结构。

具体地说，包括以下步骤：

(1)解剖显微镜下分离孕12.5-17.5天胚胎小鼠的胰腺，加入终浓度为 250U/ml的胶原酶Ⅳ200μl，37℃孵育30min，加入PRMI-1640完全培养基 终止消化，用1ml注射器反复吹打胚胎胰腺直至无明显沉淀，100目的滤网 过滤后，制备胰腺细胞的单细胞悬液；

(2)调整细胞悬液的浓度为(1-5)×10³/μl，取细胞悬液接种于底面 积为0.013cm²的微孔培养板中，20-30μl/孔，接种结束后，快速把培养 板反转，细胞间相互紧密接触形成一个细胞球；

(3)在倒置的微孔培养板培养18-24h后，在解剖显微镜下把细胞球转 移至漂浮的直径为25mm的LCR膜上，直径为35mm的小培养皿中加入2ml PRMI-1640完全培养基，LCR膜漂浮于培养基中，细胞球体在漂浮的LCR膜 上培养六天，胚胎胰腺干细胞逐渐分化为内、外分泌细胞，细胞中含大量的 分泌颗粒，培养7天后，进行免疫组织化学检测成熟胰腺细胞。

所述PRMI-1640完全培养基中按体积比加入10％胎牛血清，100U/ml青霉 素，100ug/ml链霉素，1％非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。