[发明专利]一种培养胰腺干/祖细胞的方法

权利要求书

1.一种培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将胰腺干/祖细胞接种于微孔培养板中，接种结束后，立即快速将 接种板翻转，使接种的细胞悬液和培养液的混合物在接种板表面形成吸附于 接种板的向下的悬滴，而不至于导致液体滴落或溅出；

(2)在悬滴状态下培养至细胞形成细胞球之后，将细胞球转移至漂浮的 培养膜上继续培养至形成具有生理学功能的结构。

2.根据权利要求1所述的培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，包 括以下步骤：

(1)解剖显微镜下分离孕12.5-17.5天胚胎小鼠的胰腺，加入终浓度为 250U/ml的胶原酶Ⅳ200μl，37℃孵育30min，加入PRMI-1640完全培养基 终止消化，用1ml注射器反复吹打胚胎胰腺直至无明显沉淀，100目的滤网 过滤后，制备胰腺细胞的单细胞悬液；

(2)调整细胞悬液的浓度为(1-5)×10³/μl，取细胞悬液接种于底面 积为0.013cm²的微孔培养板中，20-30μl/孔，接种结束后，快速把培养 板反转，细胞间相互紧密接触形成一个细胞球；

(3)在倒置的微孔培养板培养18-24h后，在解剖显微镜下把细胞球转 移至漂浮的直径为25mm的LCR膜上，直径为35mm的小培养皿中加入2ml PRMI-1640完全培养基，LCR膜漂浮于培养基中，细胞球体在漂浮的LCR膜 上培养六天，胚胎胰腺干细胞逐渐分化为内、外分泌细胞，细胞中含大量的 分泌颗粒，培养7天后，进行免疫组织化学检测成熟胰腺细胞。

3.根据权利要求1所述的培养胰腺干/祖细胞的方法，其特征在于，所 述PRMI-1640完全培养基中按体积比加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素， 100ug/ml链霉素，1％非必需氨基酸及2mM的谷氨酰胺。