[发明专利]一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物样品检测领域，涉及一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全球每年肺癌发生超过150万例，其中80％为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞型肺癌，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。尽管诊治技术日新月异，肺癌的5年生存率仍不到15％。要提高肺癌患者的生存率，早期诊断尤其重要。单克隆抗体具有高度特异性，在肿瘤诊断和治疗方面都成为当前的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒。

本发明的另一目的是提供该ELISA试剂盒的制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，包含如下组成：保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液：1％PBS，洗液，终止液2M H₂SO₄，TMB底物显色液，阳性对照：SPC-A1裂解液，阴性对照：人AB血清或胎牛血清和空白对照：1％PBS。

所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，优选包含如下组成：

保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10μL，抗体稀释液为1％PBS 40-50mL，洗液40-50mL，终止液2M H₂SO₄ 8-10mL，TMB底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照：SPC-A1裂解液400-600μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清400-600μL和空白对照：1％PBS 1-2mL。

其中，所述的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为200mg/L。

所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备：首次免疫用1×10⁸个SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10⁸个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1∶300000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3000r/min离心30min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1∶150 000-1∶170 000。

所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次。

所述的pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加ddH₂O至1L，最后用10M NaOH调节pH至9.6，混匀。

所述的洗液配方为：2.0g NaCl；0.2g KH₂PO₄；2.9g Na₂HPO₄·12H₂O；0.2g KCl；0.2g NaN₃；40mL ddH₂O；0.5mL吐温-20，临用前加ddH₂O至1L；SPC-A1裂解液制备方法为：将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为1×10⁶个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷1％PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150μL，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13000g离心10min；留取上清，分装后-20℃保存。