[发明专利]一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含如下组成：保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液：1％PBS，洗液，终止液2M H₂SO₄，TMB底物显色液，阳性对照：SPC-A1裂解液，阴性对照：人AB血清或胎牛血清和空白对照：1％PBS。

2.根据权利要求1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含如下组成：

保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-15-10μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10μL，抗体稀释液1％PBS 40-50mL，洗液40-50mL，终止液2M H₂SO₄ 8-10mL，TMB底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照：SPC-A1裂解液400-600μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清400-600μL和空白对照：1％PBS 1-2mL。

3.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为200mg/L，使用时稀释度为1∶4 000。

4.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备：首次免疫用1×10⁸个SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10⁸个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1∶300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3000r/min离心30min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1∶150 000-170 000。

5.根据权利要求4所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次。

6.根据权利要求5所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的pH9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加ddH₂O至1L，最后用10M NaOH调节pH至9.6，混匀。

7.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的洗液配方为：2.0g NaCl；0.2g KH₂PO₄；2.9g Na₂HPO₄·12H₂O；0.2g KCl；0.2g NaN₃；40mL ddH₂O；0.5mL吐温-20，临用前加ddH₂O至1L；SPC-A1裂解液制备方法为：将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为1×10⁶个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷1％PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150μL，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13 000g离心10min；留取上清，分装后-20℃保存。