[发明专利]一种检测荧光原位杂交质量控制的方法

说明书

技术领域

本发明涉及荧光原位杂交技术，具体的说是一种荧光原位杂交过程的质量控制方法。

背景技术

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是利用核酸序列互补的原理，对形态固定的染色体、细胞、组织切片上的目的核酸序列利用荧光分子进行标记和检测的一项分子细胞生物学技术。FISH实验流程复杂，存在诸多环节，任何一个环节处理不好均可能导致最终结果的失败。FISH的主要流程包括染色体及探针的制备、杂交、免疫检测等几个关键的环节，而每个环节又涉及到数个步骤，各步骤均有出现问题的可能。然而尽管存在如此多可能出现问题的环节，当前FISH技术尚缺乏相应的监控措施，整个实验过程犹如进行黑箱操作，只有最终结果出来之后才能知道实验是否成功。对于缺乏经验的研究者而言，一旦实验出现阴性结果，很难快速的锁定问题所在，这对于实验平台的建立和维持极为不利。

FISH实验最常见的阴性结果是完全观察不到信号。诸多原因均可以导致这种情况的出现，而探针标记的成功与否及抗体的免疫亲和反应是否发生是杂交信号产生的基础。因此，探针标记是否成功以及免疫检测条件是否合适是两个首先应当考虑的原因。对于PCR标记的探针，其成功与否可以采用探针在琼脂糖凝胶电泳时明显滞后的方法简单的检测。然而对于其他一些方法标记的探针，其分子量大小不定或缺乏分子量对照，如缺口平移法、随机引物法以及体外转录法制备的探针等，则无法采用这种策略，因此亟需一种可以鉴定是否标记成功的方法。此外，抗体作为一种蛋白质，有许多环节可能出现问题：比如抗体需要在合适的浓度下和合适的缓冲液中发挥作用，而不同的抗体其最适浓度和最适缓冲液成分并不尽相同；经常冻融抗体可能会引起抗体的失活，甚至有的批次的抗体本身就质量不合格，也需要有相应的质量控制方法。

近年来，通过复杂的条件优化过程，我们成功地在中国明对虾和栉孔扇贝中建立了FISH技术平台，同时也深深的体会到FISH技术的复杂和繁琐。为了解决FISH诸多环节的质量控制问题，我们建立了一种质量控制方法，可以对FISH过程中的大多数中间环节，包括探针标记、杂交条件、抗体质量及免疫检测条件等进行质量监控。应用这种监控方法，初次进行FISH操作的研究者可以快速的锁定出问题的中间环节，并进行相应的纠正，从而快速高效的应用FISH技术。这种监控体系的建立，对FISH技术在不同物种，尤其是基础研究缺乏的海洋生物中迅速普及有重要意义。除此之外，这些方法还可以进行相应的推广，从而应用于其他杂交技术的质量监控上，比如Southern/Northern blot、组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)及整装原位杂交(Whole amount in situ hybridization)等。

在以往的报道中，也有类似的实验技术被使用。Roche公司的产品说明书上介绍了一种方法，用来确定探针标记的效率，称为Spot Test(Catalog No.：11175025910，其是将地高辛标记的RNA探针与对照RNA点到尼龙膜上，再进行免疫检测。但是这种方法存在其自身的局限性，应用范围较窄。首先，杂交所用的尼龙膜常带有很强的自发荧光，荧光抗体产生的信号被掩盖而无法观测到，由此导致FISH等采用荧光抗体的实验无法采用这种方法检测。其次，FISH等在载玻片上进行的原位杂交实验，其某些技术参数与在膜上进行的实验并不相同，如封闭液的选择，抗体的浓度，杂交液的用量等等。因此对于载玻片上进行的实验，相关的质量控制实验也最好在玻片上进行。最后，上述提到的方法只是简单的将抗体和偶联到膜上的探针孵育，其用途仅仅限于探针及免疫检测条件的控制。

发明内容

本发明目的在于提供一种荧光原位杂交过程的质量控制方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1.一种荧光原位杂交过程的质量控制方法，其特征在于：载玻片经多聚赖氨酸处理后，设置不同的DNA样品区，将不同DNA样品溶液分别加到其上，风干后经紫外交联仪照射，使DNA结合到玻片上，得到简化的染色体片，而后进行免疫检测，通过不同区域信号的反应得出荧光原位杂交过程的质量反馈。