[发明专利]一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化分析领域，具体地说是滤膜过滤结合金属氧化物在富集内源性磷酸化肽中的应用。

背景技术

蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰(Post Translational Modifications，PTMs)，参与并调控着生命活动的几乎所有过程，包括细胞增殖、分化，神经活动和新陈代谢等。异常的蛋白质磷酸化是人类疾病发生的根本原因之一。所以建立高灵敏度和高通量的磷酸化蛋白检测方法，对于进一步理解生命进程、发现与疾病相关的生物标志物具有重要意义。目前由于生物样品中磷酸化肽的含量低，并且在质谱检测中大量的非磷酸化肽段严重抑制磷酸化肽的离子信号，导致对磷酸化蛋白的鉴定具有挑战性。因此在质谱分析前高选择性的富集内源性磷酸化肽非常重要。固定金属离子亲和色谱(IMAC)如Ga³⁺-IMAC和Fe³⁺-IMAC和金属氧化物亲和色谱(MOAC)如TiO₂等因其对磷酸化肽的高选择性被广泛应用于磷酸化蛋白组学研究中。

血清中含有来源于几乎所有细胞、组织的蛋白及代谢产物，能够直接反映机体的生理、病理状况，是对各种疾病研究的最有价值的样本之一。但由于血清成分极其复杂，同时具有很高的动态范围，使得血清中内源性磷酸化肽的检测面临巨大挑战，至今相关报道很少。Hu L.H.等利用一种基于有序介孔材料的固定化钛离子亲和色谱(Ti⁴+-IMAC)材料直接从人的血清中富集并检测到4个内源性磷酸化肽[Hu LH，Zhou HJ，Li YH，Sun ST，Guo LH，Ye ML，Tian XF，Gu JR，Yang SL，Zou HF.Anal.Chem.，2009，81(1)：94-104]。我们利用氧化锆(ZrO₂)包覆介孔氧化硅材料直接从人血清中富集到12个内源性磷酸化肽[Wan HH，Yan JY，Yu L，Zhang XL，Xue XY，Li XL，Liang XM.Talanta，2010，82(5)：1701-1707]。以上两种方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根与富集材料中的金属元素相互作用实现了磷酸化肽的选择性富集。但是血清样品中含有大量的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，这些化合物都含有磷酸根，特别是RNA和DNA中含有的大量的磷酸根。这些含有磷酸根的化合物可能在上样过程中与低丰度的磷酸化肽竞争富集材料上的作用位点，从而降低了血清中磷酸化肽的富集选择性。因此，如何有效地去除这些大分子量干扰化合物，提高血清中低丰度磷酸化肽富集检测方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，能对痕量磷酸化肽进行选择性富集。

本发明采用的技术方案为：

一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，首先将血清样品采用滤膜(ultrafiltration membrane)截留、去除血清中的大量蛋白、DNA和RNA等大分子量干扰化合物，降低了样品的复杂性，然后利用金属氧化物富集滤膜滤过液中的痕量内源性磷酸化肽；

所述滤膜的截留分子量在5000-20000Da之间；

所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上。

金属氧化物材料的粒径大小为0.2-100微米，孔道直径大小为1-100纳米。

滤膜截留的具体操作采用离心模式；

在离心模式下，血清样品经溶液稀释后，转移至滤膜管中，用离心机离心，得到过滤液；

血清样品稀释时采用的稀释溶液为下述溶剂之一，

1)体积浓度为5-60％甲醇，pH 2-7；

2)体积浓度为1-20％乙腈，pH 2-7；

3)体积浓度为1-40％乙醇溶液，pH 2-7；

稀释溶液的用量为2-20倍血清样品体积。

离心温度为4-35℃，离心速率为5000-20000g，离心时间是0.1-48小时。

金属氧化物富集磷酸化肽的具体操作采用柱固相萃取模式或在离心模式；

在柱固相萃取(SPE)模式下采用金属氧化物富集磷酸肽时，将滤膜的过滤液旋干后，采用冲洗溶剂溶解样品后上样到以金属氧化物为填料的SPE柱上，采用冲洗溶剂洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂富集磷酸化肽；

或在离心模式下，将滤膜的过滤液与金属氧化物混合，采用冲洗溶剂洗脱、离心洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂洗脱、离心富集得到磷酸化肽；