[发明专利]一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法

权利要求书

1.一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法，其特征在于：

首先将血清样品采用滤膜截留，然后利用金属氧化物富集滤膜滤过液中的痕量内源性磷酸化肽；

所述滤膜的截留分子量在5000-20000Da之间；

所述金属氧化物材料包括氧化钛、氧化锆、氧化铝、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或二种以上。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：

金属氧化物材料的粒径大小为0.2-100微米，孔道直径大小为1-100纳米。

3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：

滤膜截留的具体操作采用离心模式；

在离心模式下，血清样品经溶液稀释后，转移至滤膜管中，用离心机离心，得到过滤液；

血清样品稀释时采用的稀释溶液为下述溶剂之一，

1)体积浓度为5-60％甲醇，pH 2-7；

2)体积浓度为1-20％乙腈，pH 2-7；

3)体积浓度为1-40％乙醇溶液，pH 2-7；

稀释溶液的用量为2-20倍血清样品体积。

4.按照权利要求3所述方法，其特征在于：离心温度为4-35℃，离心速率为5000-20000g，离心时间是0.1-48小时。

5.按照权利要求1所述方法，其特征在于：

金属氧化物富集磷酸化肽的具体操作采用柱固相萃取模式或在离心模式；

在柱固相萃取模式下采用金属氧化物富集磷酸肽时，将滤膜的过滤液旋干后，采用冲洗溶剂溶解样品后上样到以金属氧化物为填料的SPE柱上，采用冲洗溶剂洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂富集磷酸化肽；

或在离心模式下，将滤膜的过滤液旋干后，采用冲洗溶剂溶解样品后金属氧化物混合，采用冲洗溶剂洗脱、离心洗去非磷酸化肽，利用洗脱溶剂洗脱、离心富集得到磷酸化肽；

冲洗非磷酸化肽时采用的冲洗溶剂为下述溶剂之一，

1)含有30-500mg/mL乳酸的体积浓度为20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 2.0-4.3；

2)含有1％-5％三氟乙酸的体积浓度为20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-3；

3)含有1％-5％甲酸的体积浓度为20-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-4；

洗脱磷酸化肽时采用的洗脱溶剂为下述溶剂之一，

1)体积浓度为1-10％的氨水溶液，pH 10-13；

2)体积浓度为1-10％的吡咯溶液，pH 10-13。

6.按照权利要求5所述方法，其特征在于：柱固相萃取模式下或离心模式下，

金属氧化物与滤膜的过滤液质量比例为10-200∶1，富集温度为4-60℃。

7.按照权利要求5所述磷酸化肽分离富集方法，其特征在于：

冲洗溶液的用量为3-40倍金属氧化物体积的冲洗溶液；洗脱溶液的用量为3-40倍金属氧化物体积的洗脱溶液。