[发明专利]H1N1、PRRSV、O-FMDV四重检测试剂盒有效
申请号: | 201110336914.1 | 申请日: | 2011-10-31 |
公开(公告)号: | CN102676691A | 公开(公告)日: | 2012-09-19 |
发明(设计)人: | 胡萌;王业富 | 申请(专利权)人: | 武汉大学 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64 |
代理公司: | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人: | 薛玲 |
地址: | 430072 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | h1n1 prrsv fmdv 检测 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种甲型H1N1流感病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及O型口蹄疫病毒四重同步核酸定量检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
甲型H1N1流感病毒为A型流感病毒,正黏病毒科。新分离的病毒多为丝状,颗粒呈多形性,直径为80~120nm。病毒粒子有囊膜与纤突,核衣壳螺旋形对称。基因组由8条单链负义分节段RNA片段组成,分别编码一到两种蛋白,具体为PB2编码PB2聚合酶,PB1编码PB1聚合酶,PA编码PA聚合酶,HA编码血凝素HA,NP编码核蛋白NP,NA编码神经氨酸酶NA,M编码基质蛋白M1、M2,NS编码非结构蛋白NS1、NS2。每节段两端均有末端重复序列,所有节段3’端核苷酸序列相同。5’端有与3’端核苷酸序列互补的保守区段和重复序列。整个基因组约13.5kp。M为流感病毒的分类依据之一,根据M及NP,流感病毒被分为A、B、C三种类型,而HA则为A型流感病毒的进一步分类依据之一,根据HA及NA抗原抗性,可将A型流感病毒共分为16中HA亚型及9中NA亚型,因此理论上A型流感病毒存在135中亚型可能性。通过M鉴别A型,HA鉴别H1,理论上可将H1N1特异性的检测出来。确定目标基因及其相对保守的序列,合成相应的引物探针,达到特异性的检测甲型H1N1流感病毒的目的。不仅如此,M基因及HA基因编码的蛋白均为功能性蛋白,如M蛋白可裂解为M1及M2,M1蛋白同囊膜结合,其固定支撑作用,而M2蛋白则形成四聚体分部于囊膜内部,可调节病毒pH值从而有利于病毒侵染过程中的基因组释放,M2对病毒复制过程中调节宿主细胞高尔基体的pH值也具有很大作用。HA为跨膜蛋白,其主要成分位于膜外,以唾液酸(N-乙-神经氨酸)为受体,通过膜融合,介导病毒颗粒进入细胞。因此,研究该基因片段对进一步深入的研究病毒的致病机理至关重要。甲型H1N1流感病毒虽然是一种新型病毒,但是病人感染这种病毒后的表现症状却和一般的流感基本相同,因此,很难从症状上判断到底是不是感染了甲型H1N1流感。其症状与普通感冒几乎是一样的。从临床症状上基本无法区别,必须得通过实验室的检测,才能确诊。本发明通过设计针对Matrix基因及血凝素H1基因的LNA探针及引物,以此来特异性检测检测甲型H1N1流感病毒,灵敏度高,特异性强,可大批量检测。
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,俗称猪蓝耳病毒,为套式病毒目,动脉炎病毒科、属,分血清型有美洲型及欧洲型两种,两型间核苷酸序列差异较大,而对型内而言,欧洲型较为保守,美洲型变异较大,我国目前流行的为美洲型。PRRSV病毒粒子有囊膜及纤突,直径50~60nm,基因组为不分节段的单股正义RNA组成,含8个开放阅读框,点突变率高,存在基因重组现象。目前针对高致病性猪蓝耳病毒的核酸检测,目标基因大致为RNA Pol,ORF5、6、7区域,根据以上H1N1叙述的理由,选定GP5为目标基因,GP5为PRRSV的主要结构蛋白,也是重要的功能性蛋白,该蛋白含病毒的6个抗原决定簇,其中一个为血清型特异性线性中和决定簇,能在体外中和抗体,是病毒的主要免疫性保护性抗原。良好的免疫原性及反应原性决定了该核酸及蛋白在疫苗研究等方面的重要意义。PRRS是危害养猪业最严重的疾病之一,除疾病本身造成危害外,更重要的是PRRSV感染机体,导致机体免疫抑制,致使很多其它病原体(PCV2、链球菌、APP和副猪嗜血杆菌、CSFV等)继发感染或混合感染,从而导致猪场很高的死亡率和较大的经济损失。根据流行病学、临床症状和病理变化可对高致病性蓝耳病做出初步诊断。但确诊需要实验室进行病毒分离鉴定或用分子生物学检测方法,本研究通过检测GP5来诊断PRRSV。
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