[发明专利]一种抗除草剂莎稗磷的特异性抗体

说明书

技术领域

本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含莎稗磷原有结构的化合物作为莎稗磷半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。 

背景技术

除草剂是近20年来逐渐发展起来的一种农药类型，随着化学工业的发展，除草剂的品种也逐渐增多。在我国研制和投产的除草剂也已达数十种。有些除草剂具有致畸作用，除草剂的安全性已经引起人们的关注，应注意除草剂对环境的污染和人畜毒性作用问题。使用除草剂能在粮食等中残留，通过食物链而使人畜发生慢性危害作用。日本肯定列表制度《食品中农业化学品残留限量食品卷/药品卷》中莎稗磷在大米(糙米)中的检测限为0.05mg/kg；《食品中农用化学品残留检测方法增补本1》中莎稗磷的气质测定低限为0.025mg/kg；《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(2008-09-04发布2009-03-16实施)中运用气相色谱-质谱法对大米、糙米、大麦、小麦和玉米5中食品中110种农药残留进行测定其中莎稗磷的测定低限为0.01mg/kg。 

然而，莎稗磷由于其分子量为367.84，小于1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或气相色谱质谱法联用等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。 

而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为莎稗磷残留研究提供了一条新的分析检测途径。 

发明内容

本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。 

本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的莎稗磷半抗原，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。 

(1)N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺(简称CCPA)的合成 

原料N-异丙基对氯苯胺与三乙胺、氯乙酰氯按照投料比是1∶1∶1在无水甲苯中反应，保持温度在110℃回流5-6h。反应完毕后，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐至滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥。产物过硅胶柱纯化(洗脱剂乙酸乙酯∶正己烷＝1∶10，每10ml正己烷加200μl冰乙酸)，TLC跟踪硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，有白色结晶析出。正己烷洗涤析出目标物。 

(2)半抗原的合成 

巯基乙酸与CCAP按照摩尔比1∶1投料比在氢氧化钠溶液中反应，回流2h，用浓盐酸酸化，过滤，水洗，得到目标产物。 

(3)半抗原于DMSO中超声2h溶解。再按照摩尔比半抗原∶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)为1∶5∶2搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。 

(4)人工抗原的合成：将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到牛血清白蛋白(BSA)溶液中，4℃搅拌反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，得到免疫原。 

(5)包被原的制备 

按照摩尔比半抗原∶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)为1∶5∶2搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。 

将活化酯液逐滴缓慢地加入到卵清蛋白(OVA)溶液中，4℃搅拌反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，制得包被原。 

(6)莎稗磷酶标抗原的制备方法