[发明专利]一种抗除草剂莎稗磷的特异性抗体

权利要求书

1.除草剂莎稗磷的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大耳兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的除草剂莎稗磷人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺(CCPA)的合成

称取5.859g N-异丙基对氯苯胺、28ml无水甲苯、3.57g三乙胺置于圆底烧瓶中，在室温搅拌下，利用恒压滴液漏斗向其中逐滴滴加3.92g氯乙酰氯，控制滴加的速度使温度保持在65℃以下，滴加完毕后，保持温度在110℃回流5-6h，冷却，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐，滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，得到一深色溶液，将深色溶液过硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，析出的白色结晶即为N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺；

(2)半抗原的合成

称取2.25g氢氧化钠溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg巯基乙酸，搅拌15min后，向其中投入354.24mg的CCPA，回流2h，冷却，用浓盐酸酸化至pH＝1.过滤，水洗，得到半抗原的白色固体；

(3)称取4.568mg半抗原于一棕色小瓶中，加入350μl二甲基亚砜(DMSO)，超声2h，半抗原溶解后再分别称取8.711mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、6.242mg N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；

(4)人工抗原的合成

将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4℃反应过夜，反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存；

3.权利要求1所述的莎稗磷酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

称取1.02784mg半抗原于一棕色小瓶中，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，超声2h，半抗原溶解，再分别称取1.96mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1.4045mg N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；然后准确称取5mg的辣根过氧化物酶(HRP)溶解于2ml的NaHCO₃溶液中，将上述的活化酯溶液于冰浴中缓慢加入到HRP溶液中，4℃条件下搅拌过夜。后用pH7.4磷酸盐缓冲液透析3天，加入硫柳汞，4℃冰箱保存；

4.权利要求1所述的除草剂莎稗磷抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗莎稗磷的特异性抗体。