[发明专利]BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法，该质粒用于检测hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用，便于对细胞内microRNA调控的检测，本发明尤其可应用于肿瘤的识别及microRNA类抗肿瘤机制的研究。 

背景技术

据世界卫生组织(WHO)的《世界癌症报告》报道，截止到2020年，全球癌症发病率将增加50％。目前，每年新增癌症患者1000万人，与1990年相比，全球癌症患者的发病率增长了19％，死亡率增长了18％。现有技术公开了BCL2致癌基因家族对细胞凋亡的调控失调一直是肿瘤发生过程中的重要途径。BCL2是抑制细胞凋亡基因的BCL2家族中的重要一员，在调节线粒体途径的凋亡过程中发挥了至关重要的作用。目前临床实践中主要是通过拮抗Bcl-2家族抗凋亡蛋白或降低其水平来达到促进肿瘤细胞凋亡的目的，如采用反义寡核苷酸治疗等。 

MicroRNA(miRNA)是近年研究发现的一类非编码小RNA分子，是由机体内源基因转录出长约70nt的发夹结构前体，然后被Dicer酶切割后产生的长度约22nt非编码单链核苷酸片段。microRNA通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式调节特异基因的表达，参与调控了生物体生长和发育等多种复杂的生命过程。miRNA在进化上高度保守，许多miRNA在相差甚远的物种之间也有较高的同源性。最近的研究表明，超过50％的miRNA基因位于肿瘤相关的基因区域，这提示了miRNA与肿瘤的发生和发展密切相关。而microRNA行使功能主要是与RISC结合，通过不完全或完全的匹配方式，识别、结合靶基因的3-UTR，在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而进一步调控多种生物学行为，如发育进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病、以及肿瘤发生。 

近期有关研究人员，通过研究microRNA在细胞凋亡通路里的功能试图发现hsa-mir-1915对BCL2的抑制作用等，为细胞内microRNA检测提供一个新的研 究方法，进而应用于microRNA的抗肿瘤研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法。 

本发明的进一步目的是提供上述BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒的用途。 

本发明通过分子克隆的方法构建构BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒，用来检测细胞内hsa-mir-1915的表达，进而应用于microRNA类抗肿瘤机制的研究。 

本发明中，通过生物芯片技术研究microRNA在细胞凋亡通路里的功能发现hsa-mir-1915对BCL2有抑制作用，其中，主要是通过BCL2的3-UTR区的结合，来调节BCL2蛋白的表达，进一步调节细胞凋亡的进程，从而可以起到抑制肿瘤的作用；所述的hsa-mir-1915可以通过与BCL2的3-UTR区结合，影响BCL2的3-UTR表达。 

具体而言，本发明的BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒，通过下述技术方案施现： 

根据生物信息学数据库miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)预测hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，将其中的包含人BCL2基因的3-UTR区的序列(序列1)扩增，插入双荧光素酶报告基因质粒pGL3-promoter的Xba I位点，构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒。所述的BCL2基因3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒构建流程如图1所示。 

本发明的通过构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒的方法可以检测细胞内hsa-mir-1915的表达，从而标示细胞内特异的microRNA表达水平，为细胞内microRNA检测提供新的研究方法；所构建的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒可用于检测细胞内hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用；进一步用于microRNA的抗肿瘤研究中。 

附图说明

图1是本发明BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒构建流程图。 

图2显示了本发明BCL2基因3-UTR区域的序列。 

具体实施方式

实施例1 

1)生物信息学数据库miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)查询hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，在BCL2的3-UTR区域(如图2所示)。