[发明专利]BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种凋亡抑制基因BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒，其特征是，通过下述方法构建：

根据生物信息学数据库miRDB预测hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，将其中的包含人BCL2基因的3-UTR区的序列扩增，插入双荧光素酶报告基因质粒pGL3-promoter的Xba I位点，构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒；所述的BCL2基因的3-UTR区具有序列1的结构。

2.权利要求1的凋亡抑制基因BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

1)生物信息学数据库miRDB查询hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，获得BCL2的3-UTR区域；

2)根据序列信息(NCIBI：NM_000633)，采用primer 5软件设计BCL2的3-UTR区引物序列，并加入酶切位点Xba I的序列；以人基因组总DNA序列为模板，扩增大小2270bp；

3)用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒对BCL2-3-UTR片段回收；

4)选用Xba I限制性内切酶酶切步骤3的BCL2-3-UTR片段，

其中，酶切体系：

PCR仪37℃酶切过夜；

5)pGL3-promoter质粒酶切及脱磷酸化

其中，酶切体系：

pGL3-promoter质粒去磷酸化体系：

6)将BCL2-3-UTR片段连入pGL3-promoter载体

分光光度计测pGL3-promoter载体及BCL2-3-UTR回收产物浓度，确定酶连体系质粒及目标DNA片段加入量；

7)将构建的质粒pGL3-p-BCL2-3-UTR转化入大肠杆菌DH5α内，平板培养获取单菌落，

8)菌液提取质粒，测序验证质粒构建结果。

3.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤2)的扩增BCL2基因的3-UTR区的序列的引物为：

Sense：GCTCTAGA TTGGAAATCCGACCACTA，

Antisense：GCTCTAGA TGGCAGGATAGCAGCAC。

4.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤2)的BCL2基因的3-UTR区的序列扩增产物具有序列4的结构。

5.权利要求1所述的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒在用于检测细胞内hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用中的用途。

6.权利要求1所述的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒在用于抗肿瘤机制研究方法中的用途。