[发明专利]一种抗5-羟甲基糠醛的抗体

说明书

技术领域

本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含5-羟甲基糠醛原有结构的化合物作为5-羟甲基糠醛半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。 

背景技术

近年来，随着生活水平的提高，油炸食品中的有害致癌物质已经引起人们的广泛关注。5-羟甲基糠醛是油炸食品中的一种普遍存在的物质。它是具有一个呋喃环结构的糠醛化合物，主要是由己糖在酸和加热条件下分解而产生的。它广泛存在于含有糖类物质的食品中，如面包、薯片、苹果汁、速溶咖啡、婴儿乳制品、蜂蜜、牛奶等。有关研究表明5-HMF可能会引发并促进结肠小囊异常生长(ACF)，具有一定程度的基因毒性，并且对眼、粘膜或皮肤有刺激性，食之过多会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害。尽管关于5-羟甲基糠醛的毒副作用还存在着一定争议，但是它的研究及检测对医学领域同样有着重要的参考依据。按照GB18796-2005中规定蜂蜜中5-羟甲基糠醛最大含量不得超过40ug/g，国际果汁加工联合会(IFFJP)建议果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为5～10ug/ml，浓缩果汁中最大残留限量为25ug/ml。 

然而，由于5-羟甲基糠醛的分子量为126.1，小于1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或质谱等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难以满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。 

而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为5-羟甲基糠醛残留研究提供了一条新的分析检测途径。 

发明内容

本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测 识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。 

本发明为达到以上目的，所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的5-羟甲基糠醛半抗原，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。 

(1)将5-羟甲基糠醛加入少量新制的四氢呋喃溶液中使其溶解，再依次加入4-二甲基吡啶，三乙胺，琥珀酸酐，投料比为：1∶1∶2～5∶2～5，在60℃油浴中搅拌反应9h。反应完毕后，在减压条件下除去溶剂得到初级半抗原产物，再经200～300目的硅胶柱纯化并减压蒸发溶剂后得到较纯的目标产物。 

通过配制适宜极性展开剂进行柱层析来进行纯化。其中展开剂配比为：甲醇∶二氯甲烷＝1∶8～10，再加入约5％冰乙酸。 

(2)称取半抗原溶于适量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后再加入DCC和N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)，投料比例为：1∶5～10∶2～5，混合后于室温避光条件下反应24～48h，取反应液于4000r/min，4℃条件下离心10～20min，取上清液作为含有活化酯的溶液1. 

本发明还提供了上述5-羟甲基糠醛半抗原的用途，是用作动物免疫的抗原体系的原料。 

(3)人工抗原的合成：将载体蛋白BSA溶于磷酸盐缓冲液中(溶液2)，然后在冰浴条件下将含有活化酯的溶液1缓慢加入到溶液2中。滴加完毕后3～5℃下搅拌反应过夜，然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到5-羟甲基糠醛免疫原。 

(4)包被原的制备 

用5-羟甲基糠醛活化酯与卵清白蛋白(OVA)连接即制成包被抗原，用于包被反应。 

(5)抗体的制备及纯化： 

免疫动物选择新西兰大白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，分别编号为1号、2号。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。