[发明专利]一种抗5-羟甲基糠醛的抗体

权利要求书

1.5-羟甲基糠醛的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)半抗原的合成

将144.9mg 5-羟甲基糠醛加入少量新制的四氢呋喃溶液中使其溶解，再依次加入4-二甲基吡啶140.3mg，三乙胺0.317ml，琥珀酸酐230mg，在60℃油浴中搅拌反应9个小时，溶剂在减压条件下被除去，而残留物用体积比为1∶9.5∶0.05的甲醇/二氯甲烷/冰乙酸溶解，初级产物通过色谱柱用体积比为1∶9.5∶0.05的甲醇/二氯甲烷/冰乙酸纯化，所得到的产物经过收集，真空条件下旋转蒸发而得到相对纯净的淡黄色半抗原；

(2)半抗原活化酯的合成

精确称取半抗原3.42mg溶于200μl N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后再加入31.21mg的：N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和8.71mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混合后于室温避光条件下反应24h，取反应液于4000r/min，4℃条件下离心10min，取上清液作为含有活化酯的溶液1；

(3)人工抗原的合成

载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)20mg溶于4ml pH值为7.4的0.01mol/ml的磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后在冰浴条件下将含有活化酯的溶液1缓慢逐滴加入到BSA中，滴加完毕后放于4℃冰箱内过夜，将反应液装入透析袋后，4℃下pH＝7.4的0.01mol/mL的PBS中透析3天，每天换透析液3-4次，透析完后，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存；

3.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

取5-羟甲基糠醛半抗原1.03mg溶于200ul DMF中，再加入9.4mg DCC和2.62mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，磁力搅拌避光反应24h合成活化酯。采用上述合成的活化酯4℃，4000r/min离心后取上清液作为溶液A，冰浴条件下将溶液A逐滴加入含5mg辣根过氧化酶(HRP)的浓度为130mmol/L，pH＝8.1的2ml碳酸氢钠缓冲液中，4℃反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，再在4℃下pH＝7.4的0.01mol/ml PBS中透析3天，每天换透析液3-4次，透析完后即可得到酶标抗原，用于显色反应；

4.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周、6周和8周后免疫四次，免疫后10天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用1.0mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗5-羟甲基糠醛的特异性抗体。