[发明专利]重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用

说明书

技术领域

本发明属于重金属镉离子免疫化学和残留分析技术领域；涉及无机螯合化学，免疫化学，生物化学及物化测试技术等；特别涉及具有双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)人工特异性抗原的设计合成，和免疫动物特异性抗体的制备及其在建立免疫分析方法方面的应用。

背景技术

重金属是一类很危险的污染物，在生物体内长期积累不可降解，在极其微量的情况下也会产生不良后果。各种生态系统都不同程度受到重金属的影响。重金属通过食物链沉积到人体中，可引起各种疾病，因此重金属在环境、农产品、中草药中残留监测都是非常重要的。

重金属的检测常规方法主要有比色法、紫外分光光度法、原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)，近年还发展了感应耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子原子发射光谱仪联用(ICP-AES)及高效液相色谱法(HPLC)等。比色法和紫外分光光度法所需仪器简单、操作简便，但准确度相对较差，受多种金属的干扰，选择性差。原子吸收光谱法(AAS)和原子荧光光谱法(AFS)具有检出限低，准确度高，选择性高，谱线较简单，谱线干扰少，分析速度快等优点，目前被广泛采用。感应耦合等离子体质谱法(ICP-MS)可同时或顺序测定多种金属元素，对高温金属元素快速分析，但其价格昂贵，易受污染。利用痕量金属离子与有机试剂形成稳定络合物后用HPLC分离，紫外可见检测器检测，可以多种元素同时测定。但是由于络合剂选择有限，此方法仍有局限。

以上的镉离子检测方法多采用昂贵的化学仪器，需要熟练的操作人员及在远离采样现场的实验室里进行，需要繁琐耗时的采样、运输和存储等步骤。而酶联免疫学法检测灵敏度高、重复性好、成本低廉、简便快捷、样品容量大、时间短，这些优点使其获得了很大的发展空间。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为重金属残留研究提供了一条新的分析检测途径。

发明内容

需要解决的问题：

针对上述情况，当前急需一种简易快速有效地检测重金属镉离子方法。本发明的目的是通过双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)将重金属镉离子和匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联合成人工抗原：独特之处在于，镉离子能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆的反应，导致动物中毒，因此选择了双功能螯合剂ITCBE螯合镉离子，形成能被动物免疫系统识别的螯合物，但这些重金属螯合物是分子量低于1kD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反应。而ITCBE除了能螯合镉离子之外，还能与载体蛋白KLH偶联，可以成功获得人工抗原。免疫动物诱导产生亲和性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，准确检测重金属镉离子。

技术方案

本发明设计、合成了重金属镉离子人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量地检测中药白芷中微量小分子目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲和性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测重金属镉离子在样本中的残用量。该技术研究的关键是人工抗原的合成及抗体的制备。

重金属镉离子人工抗原和抗体，其特征在于选择双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，分子量MW为439.44，结构为：

人工抗原的合成路线，如下图：

其中人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗全血清，纯化制得抗体。

重金属镉离子特异性抗体的制备方法：

(1)抗原设计与合成

采用双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，将重金属镉离子和匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，具体做法是：

称取1.4mg ITCBE溶于1mLDMSO中，将1000mg/L镉溶液标品710μL缓慢滴加到ITCBE溶液中，使用三乙胺调节PH至7.4，在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h。10mg KLH溶解在20mmol/L的Hepes缓冲溶液中，并将上述螯合好的反应液缓慢滴加到KLH溶液中，使用三乙胺调节PH至9.6。在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h后，用5mmol/L的HEPES缓冲溶液透析三天。

(2)包被抗原的制备