[发明专利]重金属镉抗体及其在中药中镉残留检测的应用

权利要求书

1.重金属镉离子人工抗原和抗体，其特征在于选择双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)络合镉离子合成半抗原，半抗原与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联合成人工抗原，半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成包被抗原，其中人工抗原再经免疫动物，取血，分离含有抗体的全血清，纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的重金属镉离子人工抗原和抗体的制备抗法，其特征在于使用下述步骤制得：

(1)人工抗原的合成

采用双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，将重金属镉离子和匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，具体做法是：

称取1.4mg ITCBE溶于1mLDMSO中，将1000mg/L镉溶液标品710μL缓慢滴加到ITCBE溶液中，使用三乙胺调节PH至7.4，在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h，10mg KLH溶解在20mmol/L的Hepes缓冲溶液中，并将上述螯合好的反应液缓慢滴加到KLH溶液中，使用三乙胺调节PH至9.6。在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h后，用5mmol/L的HEPES缓冲溶液透析三天；

(2)包被抗原的制备

采用双功能螯合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)，将重金属镉离子和牛血清白蛋白(BSA)偶联，具体做法是：

称取1.33mg ITCBE溶于1mLDMSO中，将1000mg/L镉溶液标品716μL缓慢滴加到ITCBE溶液中，使用三乙胺调节PH至7.4，在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h。10mgBSA溶解在20mmol/L的Hepes缓冲溶液中，并将上述螯合好的反应液缓慢滴加到BSA溶液中，使用三乙胺调节PH至9.6。在25℃下，使用磁力搅拌器搅拌24h后，用5mmol/L的Hepes缓冲溶液透析三天；

3.权利要求1所述的重金属镉离子人工抗原、包被抗原和抗体在中药中重金属镉离子的免疫检测方法中的应用，其特征在于方法如下：

(1)将2-5克中药样品粉粹成粉末，使用5倍体积的高氯酸浸泡过夜，然后装入高压消解罐在160℃-180℃消化至溶液澄清，使用四乙基乙二胺调节pH至中性，过0.22μm的微孔滤膜并使用双蒸水定容到50ml作为待测样品；

(2)包被：将制备好的Cd-ITCBE-BSA包被原溶于pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液中，将Cd-ITCBE-BSA包被原稀释为1.0μg/100μL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μL，室温放置过夜或者37℃恒温温育2～3小时，用含有Tween200.05％(V/V)磷酸盐缓冲液(PBST)洗液洗涤三次；

(3)封闭：每孔加入200μL0.5％脱脂乳粉/磷酸盐缓冲液(PBS)封闭液，封闭1小时，用洗液洗涤三次；

(4)加样：用二乙基四乙胺(EDTA)将待测样品螯合后溶于PBS中，重金属镉离子标品(Cd-EDTA)也溶于PBS中，加样时每孔加入50μL上述待测样品或标样；

(5)竞争反应：将重金属镉离子抗体溶于PBS缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μL抗体溶液，孵育60min后，用PBST洗涤四次；

(6)显色：向每微孔加100μL羊抗兔酶标二抗，37℃反应30分钟，用PBST洗涤五次后每孔加入100μL由5mg四甲基联苯胺溶于1ml底物缓冲液并加入5μL双氧水溶液配成的底物溶液，室温下反应0.5小时；

(7)终止：向各微孔中加入50μL硫酸终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值。