[发明专利]烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种利用普通烟草种内的基因表达调控序列和功能基因对普通烟草种质进行改良的方法。 

  

背景技术

转基因技术打破了物种界限，使不同物种间的基因可以进行前所未有的新组合，但是在转基因作物育种中，往往既引入了其他物种的功能基因、启动子、终止子等表达调控序列，也转入了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因、抗生素或除草剂抗性基因等选择标记。这些转基因作物在展现优异特性的同时，也给社会大众带来环境安全和食品安全等多方面忧虑，尤其是转基因植物用来生产功能食品、药品和工业原料，人们担心这些分子及其产物可能会污染环境和人类的食物链。 

这些顾虑延滞了转基因作物的生产和应用，因此转基因安全研究也成为新的科学热点领域，国际上就转基因的安全性方面也进行了许多研究和探索，新一代植物转基因技术不断涌现，如采用全植物源启动子和基因进行转化植物，而不采用微生物或动物来源DNA的转化法（All-native DNA transformation）、用一系列分子策略阻止转基因运动的基因利用限制技术（Genetic use restriction technology，GURT）、无标记共转化技术（Marker free co-transformation）、转化基因表达功能后诱导删除技术（gene-deletor）等。 

这些研究主要通过各种技术手段对转入作物的外源DNA序列的迁移，实现绝大部分的限制或删除，但依然难以消除转基因作物给食品安全和环境安全带来的顾虑，而种内基因转移是容易被公众接受的，有助于消除以上一些安全方面的顾虑。如果将种内基因转移与无标记基因转化相结合，获得的改良作物将非常接近传统杂交育种的产物，但这种策略在烟草上的研究和应用还没有报道。 

烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）是目前世界上研究较为深入的模式病毒，是单链RNA（ssRNA）病毒。TMV具有寄主范围广、抗逆性强、生产危害大等特点，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和苋科等多种植物，在全世界主要烟草产区均有分布，使烟草和其他农作物的产量和品质大大降低。据报道全世界每年仅TMV 造成的危害就超过1 亿美元。抗TMV烟草种质的培育主要通过传统杂交育种，但很难有效打破抗性基因与不利性状基因的连锁，再加上杂交育种周期长，导致优质可用的种质材料较难培育，因此采用烟草TMV抗性的种内基因转化与无标记基因选择相结合，以改良烟草将具有广阔的应用潜力。 

  

发明内容

本发明目的是克服上述缺点而提供的一种对烟草进行基因工程改良中，同时避免非烟草源基因污染和标记基因引起的环境风险，实现转基因安全的烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法。 

    本发明的一种烟草普通花叶病毒（TMV）抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤： 

（1）克隆烟草Ubi.u4基因的组成型表达启动子Pubi.u4：

烟草组成型表达启动子Pubi.u4是根据基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点。用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因796 bp的 Pubi.u4启动子。

Pubi.u4启动子的扩增引物为： 

Ubi -1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’； 

Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’； 

    （2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列: 

烟草终止子Tubi.u4序列为基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的终止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位点（HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI）序列和基因银行登记号(Genbank Accession): HM036220登录的左右边界序列组成；