[发明专利]烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法

权利要求书

1. 一种烟草普通花叶病毒抗性的种内基因改良方法，包括以下步骤：

（1）克隆烟草Ubi.u4基因的组成型表达启动子Pubi.u4：

烟草组成型表达启动子Pubi.u4是根据基因银行登记号(Genbank Accession)：X77456中提供的Pubi.u4启动子序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Ubi-1引入HindIII酶切位点，下游引物Ubi-2引入XbaI酶切位点，用PCR方法克隆烟草Ubi.u4 基因796 bp的 Pubi.u4启动子；

Pubi.u4启动子的扩增引物为： 

Ubi -1：5’- CCC AAG CTT GGA GGC TAA CTA CGT TAG AGC-3’； 

Ubi- 2：5’-TGC TCT AGA TCT GTA TAT ACA GAA AAG GTT-3’； 

    （2）人工合成终止子Tubi.u4和LB-MCS-RB序列: 

烟草终止子Tubi.u4序列为基因银行登记号：X77456中提供的终止序列；LB-MCS-RB序列由多克隆位点HindIII、XbaI、KpnI、SmaI、BamHI、EcoRI序列和基因银行登记号: HM036220登录的左右边界序列组成；

常规方法合成两端添加BamHI和EcoRI酶切位点的Tubi.u4序列，以及合成两端添加BglII酶切位点的LB-MCS-RB序列备用;

（3）克隆烟草功能基因TMV-N：

根据基因银行登记号: EF091690登录的烟草TMV-N基因的完整序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物N-1引入KpnI酶切位点，下游引物N-2引入SmaI酶切位点，用反转录PCR方法从普通烟草RNA中克隆3426 bp的烟草普通花叶病毒抗性基因TMV-N；

TMV-N基因的扩增引物为：

N-1：5’-CGG GGT ACC ATG GCA TCT TCT TCT TCT TC-3’；

N-2：5’-TCC CCC GGG TCA CCC ATT GAT GAG CTC AT-3’；

（4）构建烟草种内基因表达载体：

将克隆的Pubi.u4启动子、TMV-N基因序列和人工合成的Tubi.u4终止子、LB-MCS-RB序列分别连接到常规载体pGEM-T easy上，构建出pGEM-P、pGEM-N、pGEM-T和pGEM-LB-RB，并转化大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序，以获得正确的Pubi.u4启动子、TMV-N基因、Tubi.u4终止子和LB-MCS-RB序列；

用BglII单酶切pSH737和pGEM-LB-RB，把回收的LB-MCS-RB小片段构建到pSH737大片段上形成pSH-LB-RB；然后用HindIII和XbaI双酶切pSH-LB-RB和pGEM-P，把回收的Pubi.u4小片段构建到pSH-LB-RB上形成pSH-P；用BamHI和EcoRI双酶切pSH-P和pGEM-T，把回收的Tubi.u4小片段构建到pSH-P，从而获得烟草种内基因表达母载体pSH-P-T；

用KpnI和SmaI双酶切pSH-P-T和pGEM-N，把回收的TMV-N小片段构建到pSH-P-T形成pSH-P-N-T，从而得到由烟草组成型启动子Pubi.u4驱动烟草TMV抗性基因TMV-N表达，由烟草终止子Tubi.u4终止基因表达的烟草TMV-N种内基因表达载体pSH-P-N-T；

（5）共转化烟草外植体

将种内基因表达载体pSH-P-N-T与含β-葡萄糖苷酸酶基因和新霉素磷酸转移酶基因的表达载体pSH737分别用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，分别挑取含有表达载体pSH-P-N-T或表达载体pSH737的农杆菌单菌落，在含100mg·L^-1 卡那霉素和20 mg·L^-1 利福平的常规YEP培养基中28℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体后，按照1:1的体积比混合两载体的重悬液；挑选鲜嫩的烟草外植体于混合的重悬菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L^-1的脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为3000~4000lux，12~14h/d；每15~20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中；

（6）子代分离筛选

移栽成活的T₀代抗性转化苗切取叶片组织对β-葡萄糖苷酸酶进行染色检测，对染色呈蓝色的阳性烟株提取DNA，对嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的497 bp进行PCR扩增检测和测序验证，对PCR检测阳性的转基因烟株套袋留种，然后种植T₁代，并对T₁代继续进行GUS染色和PCR检测，最后从子代中筛选出GUS染色为阴性，但嵌合序列PCR阳性的烟株，从而获得无标记基因的烟草TMV抗性种内基因改良植株；

嵌合序列Pubi.u4-TMV-N的PCR检测引物：

    Test-1：5’-TTGATTTTGTTGTACCTGGTTGA-3’；

Test -2：5’-TCTGAGAAAACGACGATGGA-3’。