[发明专利]自体骨髓间充质干细胞人羊膜角膜贴片的制备及应用

说明书

技术领域

本发明所涉及的是再生医学领域，尤其涉及一种将自体骨髓间充质干细胞种植于人羊膜上，形成用于治疗角膜损伤的贴片的制备方法。

背景技术

角膜损伤的治疗是目前临床上比较复杂的问题。角膜分为五层，分别为角膜上皮层，前界层，角膜基质层，后界层和角膜内皮层。临床角膜疾病包括物理及化学烧伤，机械性外伤，感染，复发性翼状胬肉，Steven-Johnson综合症，类天胞疮，沙眼等，严重的结角膜疾病仍然是眼科医生复明治疗中的一大难题。角膜烧伤后角膜缘干细胞大量缺失，角膜上皮无法正常修复，角膜混浊，新生血管增加形成纤维化，继发感染后出现角膜溃疡甚至积脓，影响正常视力甚至失明。

临床上传统治疗角膜疾病的方法一般有以下几种：

一、传统的角膜移植术后短期角膜透明，其主要缺点为仅为中央φ7mm光学透明区移植，因排斥反应明显，需要长期使用免疫抑制剂配合治疗。

二、自体角膜缘移植虽然无免疫排斥反应，但材料来源受限，主要缺点为增加健眼患病的危险性，不能360°环状移植，效果受限。

三、异体角膜缘移植供体材料极为有限，治疗机会非常少，并且免疫排斥反应明显，需要长期用药，费用很高。

骨髓来源的间充质干细胞近年来备受关注缘于它很容易分离、培养和扩增，且能向骨、脂肪、软骨、神经等各个胚层的组织分化。干细胞是自我更新组织内细胞增殖与分化的源泉，在临床上，干细胞解决了器官移植所带来的器官来源问题，近期角膜缘干细胞移植成为治疗角膜疾病的热点，其主要方法是取自体或异体的角膜缘培养角膜缘干细胞，种植于羊膜上进行移植治疗角膜性疾病，但由于角膜缘来源受限，异体的角膜缘干细胞移植后排斥反应明显，所以虽有显著的治疗效果但未在临床普及应用。自体来源的干细胞解决了器官移植的免疫排斥反应问题，是临床器官移植领域的一大热点和希望的曙光。

本发明采用自体来源的骨髓间充质干细胞种于羊膜上作为承载载体治疗角膜疾病取得了一定的疗效，目前已经完成了62例动物有效性试验，实验结果显示：这种发明产品应用于临床能够促进上皮缺失的恢复，减少损伤后新生血管的形成，改善溃疡；通过视动仪分别测量角膜上皮损伤前、损伤后和移植细胞后的大鼠视力，发现有显著性差异，大鼠的视力基本恢复到正常水平；根据基质金属蛋白酶MMP-2/4的免疫荧光染色结果，证实间充质干细胞能够减少炎症反应，促进角膜上皮的恢复；通过HE切片染色可以观察到烧伤后上皮不完全，炎症反应严重，而移植细胞4周后上皮完整，炎症反应消失，细胞对上皮的恢复起到了决定性的作用。倒置显微镜下人羊膜上的骨髓间充质干细胞覆盖面积大于80％，锥虫蓝染色细胞存活率大于90％，免疫荧光染色细胞CD44和CD90阳性率均大于90％。作为新技术与临床医院合作对4例适宜的角膜病患者进行了培养骨髓间充质细胞羊膜贴片移植手术。移植后1周内，羊膜贴片无溶解和脱落，移植后8个月内无新生血管生成。术后患者恢复较好，患者视力得到提高，证明该方法能有效的重建眼表。此方法一方面避免了免疫排斥反应，另一方面解决了细胞来源问题，为临床角膜损伤的治疗指出了新方向。

发明内容

本发明的目的在于制备人羊膜负载的自体骨髓间充质干细胞贴片，观察贴片移植后角膜损伤的改善。

本发明的治疗性角膜贴片，是将自体来源的骨髓间充质干细胞种植于处理好的羊膜上，间充质干细胞在a-MEM培养基中培养保存，该培养基的主要组分为细胞生长必须的氨基酸、蛋白质、糖类和血清等。

附图说明

图1：干细胞角膜贴片外观图；

图2：干细胞在羊膜上生长图；

图3a：正常大鼠角膜；

图3b：烧伤后大鼠角膜；

图4：不同对照组大鼠术后4周角膜恢复情况图(裂隙灯照相图片)，图4a：移植间充质干细胞，图4b：移植角膜缘干细胞，图4c：移植成纤维细胞，图4d：单纯移植羊膜，图4e：阴性对照；

图5：不同对照组大鼠术后4周角膜恢复情况图(H-E染色图片)，图5a：移植间充质干细胞；图5b：移植角膜缘干细胞，图5c：移植成纤维细胞；图5d：单纯移植羊膜，图5e：阴性对照；

图6：视动跟踪仪对实验大鼠视力反射状况的跟踪图，图6a、图6b、图6c为三个不同光栅术前双眼(绿色)，术前单眼(紫色)，烧伤前单眼(黄色)的运动总路程，图6d为术前双眼，图6e为术前单眼，图6f为烧伤后单眼的运动轨迹；

图7a：单纯移植羊膜后14天MMP-2的表达(20X)；

图7b：移植间充质干细胞后14天MMP-2的表达(20X)。