[发明专利]自体骨髓间充质干细胞人羊膜角膜贴片的制备及应用

权利要求书

1.一种干细胞人羊膜角膜贴片，其特征在于在人羊膜上植入干细胞。

2.如权利要求1所述干细胞人羊膜角膜贴片，其特征在于所使用的干细胞是自体来源的骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求1所述干细胞人羊膜角膜贴片，其特征在于骨髓间充质干细胞是通过以下方法制备的：

(1)取健康人的骨髓10ml，用PBS稀释一倍；

(2)加入5ml Ficoll(密度1.077)，1500rpm离心30分钟；

(3)将中间絮状单核细胞悬液吸出，PBS洗涤2次，种于含有10％FBS的a-MEM的培养基中，8～12天后铺满瓶底；

(4)传代扩增到第三代后取2.5x10⁵细胞种植于处理好的羊膜上，加入培养基继续培养，直到细胞长满整个羊膜。

4.如权利要求1所述的干细胞人羊膜角膜贴片，其特征在于所述羊膜是通过以下方法制备的：

(1)羊膜取自剖腹产产妇的胎盘，术前检测孕母血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，结果均为阴性方可使用；

(2)临床获取羊膜后，用含有100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的PBS洗涤；

(3)羊膜由上皮层，基底膜和其下面紧凑的基质组成，先钝性分离羊膜及绒毛膜，洗涤后剪成1.2cmx1.2cm小块，将其保存在50％DMEM和50％甘油组成的保存液中，放入-80℃冻存备用：

(4)使用时取出冻存羊膜，在PBS中水化20分钟，用0.30％胰酶和0.04％EDTA消化20-40分钟；

(5)细胞刮刀刮除上皮，基底面向上铺于培养皿中，部分进行H-E染色，确定羊膜上皮已经去除。