[发明专利]一种葡萄体细胞胚发生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过体细胞胚发生途径建立葡萄高效再生体系的方法，尤其是一种葡萄体细胞胚发生的方法。

背景技术

葡萄由于再生困难、生长周期长以及基因数量多且多呈杂合状态而严重制约了分子育种工作的开展，目前葡萄生产上主要利用嫁接技术对栽培品种进行改良，随着分子生物学研究的深入和转基因技术的日趋成熟，虽然葡萄转基因育种也获得了成功，但由于转基因受体系统的不完善，从而影响了葡萄转基因育种的快速发展。

当前，葡萄再生体系发生的途径主要有器官发生途径和体细胞胚发生途径，但与器官发生相比，体细胞胚发生产生的胚性细胞分散性好，生长旺盛、生理生化代谢活跃、生命力强且易于分化，以胚性愈伤组织作为遗传转化的受体，植株再生性高，遗传操作的效果较好，因此，在葡萄转基因技术研究过程中，再生体系主要以体细胞胚发生途径为主。自1976年Mullins等从葡萄珠心愈伤组织上获得了体细胞胚以来，葡萄体细胞胚发生的研究取得了不少成功，Das等(2002)、Semenzato等(2002)通过叶片成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；Perrin等(2001)、Locco等(2001)、Rubtsova等(1999)、Jayasankar等(2000)通过花药成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；salunkhe等(1997)通过卷须成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；Motoike等(2001)通过子房成功建立了葡萄体细胞胚发生体系；Zlenko等(2002)通过叶柄成功建立了葡萄体细胞胚发生体系。虽然已有了大量的葡萄体细胞胚发生的研究，但主要还存在以下问题：①由于葡萄基因型的差异，所建立的葡萄再生体系多数仅适合个别品种；②部分再生体系的胚性愈伤诱导率偏低，仅在20％以下，不适合后期的转基因技术操作；③虽然部分再生体系的胚性愈伤诱导率较高，但操作程序较为复杂，技术难度较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种一种葡萄体细胞胚发生的方法，该方法所获再生植株性状均一、稳定，且操作步骤简单，易于遗传工程操作。

一种葡萄体细胞胚发生的方法，包括如下步骤：(1)在葡萄盛花期，采集开花前5-7天的花蕾，将采集的花蕾置于2-4℃条件下存放2-3天，再清洗消毒并吸干水分备用；(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度28±1℃；(3)暗培养45～50天后，选取步骤(2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度28±1℃；(4)暗培养时间30天后，将步骤(3)得到的诱导形成的体细胞胚继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为500-1000lx弱光照培养，光照时间16h/d，温度28±1℃；(5)弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的体细胞胚同样继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为2000-30000lx强光照培养，光照时间16h/d，温度28±1℃。

步骤(1)中清洗消毒并吸干水分是先用洗涤剂清洗5-1Omin，自来水冲洗20-30min，75％体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2％体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4-5次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分。

步骤(2)中的培养基为NN基本培养基再添加1.0-1.2mg·L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.0mg·L^-1 6-苄基氨基腺嘌呤、5.0mg·L^-1AgNO₃、60g·L^-1蔗糖和0.6g/L琼脂。

步骤(2)中用1N的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5.8～6.0。

步骤(3)中的培养基为NN基本培养基，或NN培养基大量元素、MS培养基微量元素、MS培养基铁盐和B5培养基有机元素的混合，并且添加2.0mg·L^-1萘氧乙酸、0.1-0.2mg·L^-16-苄基氨基腺嘌呤、2.5-3.5mg·L^-1吲哚乙酸、0.1g/L活性炭、3g/L蔗糖以及0.7g/L琼脂。

步骤(3)中用1N的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5.8～6.0。