[发明专利]一种葡萄体细胞胚发生的方法

权利要求书

1.一种葡萄体细胞胚发生的方法，包括如下步骤：

(1)在葡萄盛花期，采集开花前5-7天的花蕾，将采集的花蕾置于2-4℃条件下存放2-3天，再清洗消毒并吸干水分备用；

(2)将步骤(1)得到的花蕾置于解剖镜下，用无菌的解剖针刺破花瓣，将单个雄蕊取出接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度28±1℃；

(3)暗培养45～50天后，选取步骤(2)中得到的浅黄色或白色的颗粒状、质地紧实的胚性愈伤组织，将其接种在培养基上进行培养，培养条件为暗培养，温度28±1℃；

(4)暗培养时间30天后，将步骤(3)得到的诱导形成的体细胞胚继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为500-1000lx弱光照培养，光照时间16h/d，温度28±1℃；

(5)弱光照条件下培养30天后，将步骤(4)得到的体细胞胚同样继代在与步骤(3)中同样的培养基上进行培养，培养条件为2000-30000lx强光照培养，光照时间16h/d，温度28±1℃。

2.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于：步骤(1)中清洗消毒并吸干水分是先用洗涤剂清洗5-10min，自来水冲洗20-30min，75％体积百分比浓度的乙醇消毒30S后，2％体积百分比浓度的次氯酸钠溶液消毒6min，无菌水洗涤4-5次，然后用无菌滤纸吸干花蕾上多余的水分。

3.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于：步骤(2)中的培养基为NN基本培养基再添加1.0-1.2mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.0mg·L^-16-苄基氨基腺嘌呤、5.0mg·L^-1AgNO₃、60g·L^-1蔗糖和0.6g/L琼脂。

4.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于：步骤(2)中用1N的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5.8～6.0。

5.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于：步骤(3)中的培养基为NN基本培养基，或NN培养基大量元素、MS培养基微量元素、MS培养基铁盐和B₅培养基有机元素的混合，并且添加2.0mg·L^-1萘氧乙酸、0.1-0.2mg·L^-16-苄基氨基腺嘌呤、2.5-3.5mg·L^-1吲哚乙酸、0.1g/L活性炭、3g/L蔗糖以及0.7g/L琼脂。

6.如权利要求1所述的一种葡萄体细胞胚发生的方法，其特征在于：步骤(3)中用1N的盐酸或氢氧化钠调节培养基pH 5.8～6.0。