[发明专利]高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技 术领域。

背景技术

血小板因子4(platelet factor 4，PF4)属趋化性细胞因子CXC亚家族，分子量约为7.8KD， 其基因定位于4号染色体长臂。它在巨核细胞中合成，在α颗粒中包装，在血小板处于粘附、 聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板中释放。该因子与多种细 胞的生物功能有关；如PF4高度亲和肝素和带负电细胞表面的葡糖胺多糖，其在止血和血栓 形成过程中起着重要作用。PF4能够抑制内皮细胞增殖、迁移和血管生成，调节细胞凋亡， 扩大NK细胞炎症应答等，从而抑制肿瘤血管形成和维持对肿瘤细胞的非特异性免疫应答；PF4 能降低正常造血干细胞对化疗药物的敏感性，而不影响肿瘤细胞对化疗药物敏感性，其机制 是PF4可逆性地抑制细胞增殖，将细胞阻止在S期，同时还保持细胞的生存力和活力。因此， PF4可作为造血细胞的防护剂用于肿瘤临床治疗中。另外，PF4的测定不仅作为体内高凝状 态的敏感指标，而且在多种疾患的诊断和预后的判断中，PF4的测定也有相当重要的临床意 义。近来研究发现血清PF4水平可作为胰腺癌病人存活和静脉血栓栓塞形成的独立指标。因 此其开发具有很好的科研和临床价值；然而天然PF4是从人血小板中纯化出来的，价格昂贵， 产量少，远远不能满足科研和临床的需求。用基因工程方法生产PF4国内外均有研究，且均 有产品上市，但大都用单一拷贝进行表达，规模较小，价格昂贵，产量有待提高。同时，PF4 属于小分子多肽，由于其相对分子质量较小，在体内易被迅速水解，半衰期短，因此在克隆、 表达等过程中都会碰到不少困难。另外其表达量也少，在一定程度上制约了工业化生产。目 前，采用构建多拷贝表达载体的策略可以有效提高小分子多肽的表达量和稳定性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种成本低、PF4表达量高的基因工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达人PF4的基因工程菌的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种高效表达人PF4的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，其携带的 质粒中含有n个表达人PF4的基因，n＝1，2，3，4，5或6；质粒的启动子为IPTG诱导的T7Lac 启动子。优选的是：n＝4，5或6。

高效表达人PF4的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)人PF4基因的扩增：

将人PF4基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No.12序列；再以 SEQ ID No.12为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4分别为上、下游引物，进行PCR扩增， 得到SEQ IDNo.13序列；再以SEQ IDNo.13为模板，以SEQ IDNo.5、SEQ IDNo.6分别为 上、下游引物，进行PCR扩增，获得SEQ ID No.16所示的人PF4的基因，将该基因克隆至 pEASY-T3载体中，转化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T3-PF4/DH5α；

(2)PF4串联单位及第一串联单位的扩增：

以质粒pEASY-T3-PF4为模板，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8分别为上、下游引物，进 行PCR扩增，得到SEQ ID No.14序列；以SEQ ID No.9、SEQ ID No.10分别为上、下游引 物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No.15序列；以SEQ ID No.14、SEQ ID No.15 分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到PF4串联单位序列，将所述串联 单位克隆至pEASY-T1载体中，转化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T1-PF4/DH5α；

以质粒pEASY-T1-PF4为模板，以SEQ ID No.11、SEQ ID No.8分别为上、下游引物， 进行PCR扩增，获得第一串联单位序列，将所述第一串联单位克隆至pEASY-T1载体中，转 化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T1-f PF4/DH5α；