[发明专利]高效表达人血小板因子4的基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌 BL21(DE3)，其携带的质粒中含有n个表达人PF4的基因，n＝1，2，3，4，5或6；质粒的启动子为 IPTG诱导的T7Lac启动子，所述人血小板因子4为人PF4。

2.根据权利要求1所述的一种高效表达人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述n优 选4，5或6。

3.权利要求1的高效表达人血小板因子4的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步 骤：

(1)人PF4基因的扩增：

将人PF4基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No.12序列；再以 SEQ ID No.12为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4分别为上、下游引物，进行PCR扩增， 得到SEQ ID No.13序列；再以SEQ ID No.13为模板，以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6分别为 上、下游引物，进行PCR扩增，获得SEQ ID No.16所示的人PF4的基因，将该基因克隆至 pEASY-T3载体中，转化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T3-PF4/DH5α；

(2)PF4串联单位及第一串联单位的扩增：

以质粒pEASY-T3-PF4为模板，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8分别为上、下游引物，进 行PCR扩增，得到SEQ ID No.14序列；以SEQ ID No.9、SEQ ID No.10分别为上、下游引 物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到SEQ ID No.15序列；以SEQ ID No.14、SEQ ID No.15 分别为上、下游引物，两者互为模板，进行PCR扩增，得到PF4串联单位序列，将所述串联 单位克隆至pEASY-T1载体中，转化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T1-PF4/DH5α；

以质粒pEASY-T1-PF4为模板，以SEQ ID No.11、SEQ ID No.8分别为上、下游引物， 进行PCR扩增，获得第一串联单位序列，将所述第一串联单位克隆至pEASY-T1载体中，转 化大肠杆菌DH5α，得到pEASY-T1-fPF4/DH5α；

所述串联单位为：EcoR I酶切位点-Xho I酶切位点-SD序列-ATG起始密码子-His 标签-EK酶切位点-人PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述串联单位用 序列表中SEQ ID No.17表示；

所述第一串联单位为：EcoR I酶切位点-ATG起始密码子-His标签-EK酶切位点-人 PF4基因-TAATAA终止密码子-Sal I酶切位点；所述第一串联单位用序列表中SEQ ID No.18表示。

(3)PF4多拷贝载体的构建：

对质粒pEASY-T1-PF4进行EcoR I和Xho I双酶切，回收大片段；对质粒pEASY-T1-f PF4 进行EcoR I和Sal I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌DH5α，即可获 得pEASY-T 1-2f PF4/DH5α；

对质粒pEASY-T1-PF4进行EcoR I和Xho I双酶切，回收大片段；对质粒pEASY-T1-2f PF4进行EcoR I和Sal I双酶切，回收小片段；连接大、小片段，转化大肠杆菌DH5α，即可 获得pEASY-T1-3fPF4/DH5α；如此反复进行，可获得pEASY-T1-nfPF4/DH5α，所述n＝1，2，3，4，5 或6；

(4)构建多拷贝人PF4的基因工程菌：

对质粒pET28a(+)和pEASY-T1-nf PF4进行EcoR I和Sal I双酶切，分别回收大、小片段， 连接大、小片段，转化大肠杆菌BL21(DE3)，最终获得工程菌pET28a(+)-nfPF4/BL21(DE3)， 所述n＝1，2，3，4，5或6。

4.根据权利要求3所述的高效表达人血小板因子4的基因工程菌的构建方法，其特征在于所 述n优选4，5或6。