[发明专利]转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测转基因番木瓜55-1转化事件定性PCR检测方法及其衍生产品的转化事件特异性序列。

背景技术

番木瓜环斑花叶病毒(papaya ringspot virus，PRSV)是为害番木瓜的世界性毁灭病害，一旦受到侵染，便无法防治，包括清除病株、迁移检疫控制植株、应用杀虫剂防治昆虫传播病毒等措施均不能有效地控制。20世纪90年代初夏威夷大学的Fitch等 将PRSV一种温和突变体编码的衣壳蛋白(Coat protein，CP)基因转入番木瓜，获得抗PRSV的转基因植株SunUp，并培养出其F1杂交品种Rainbow，并于1997年经美国FDA组织批准进人商品化生产，番木瓜是第一个被批准进入商业化生产的转基因抗病植物，在美国广泛种植。

目前在我国商业化生产的转基因番木瓜，仅有华南农业大学李华平教授选育的高抗病毒的转基因番木瓜“华农一号”，已于2006年获得农业部授权环境安全证书，并在广东省广泛种植。随着全世界转基因番木瓜研究和实验的广泛进行，转基因番木瓜及其产品的非法生产和销售活动事件频频发生，其中绿色和平在2008年、2009年、2010年都发现我国市场上销售的国产木瓜部分均为转基因木瓜，随后发现转基因番木瓜“华农一号”的生产超出了农业部唯一允许的广东省，已经在海南非法种植。为了切实监督市场上可能存在的转基因番木瓜，维护我国消费者的知情权和选择权，加强我国转基因产品标识制度实行。目前“华农一号”番木瓜的转化事件特异性PCR检测方法已经有报道出现，而商业化最早、流通最广的转基因番木瓜55-1未见有转化事件特异性PCR检测方法的报道。

由于PCR法能够高效的扩增低拷贝数的外源DNA，是核酸现行首选的检测方法。针对PCR方法又分为筛选检测、基因特异性检测、结构特异性检测、转化体特异性检测。一、筛选检测，以转基因通用的外源基因启动子和终止子为靶序列；二、基因特异性检测，由于很多转基因载体使用相同外源基因，比如：抗除草剂基因EPSPS、PAT、BAR分别转入大豆、玉米、烟草、小麦、油菜等不同的作物中；三、结构特异性检测，是利用外源转入基因原件之间的边界序列特征，能够有效鉴定类似基因元件的不同载体序列，而且基因元件序列容易获得，引物设计方便；四、事件特异性检测，是以转基因元件之间，其中转化事件特异性检测是以外源基因与植物基因组相连接区域为检测对象，这样连接区域对不同转基因株系都是特异的，并且在基因组上是单拷贝，因此该类检测方法具有高度的特异性。目前已经建立转化体特异性检测方法的转基因转化体包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513、MON1445。

经过对现有专利和其他文献查阅，尚未发现任何关于转基因番木瓜55-1转化事件外源插入载体序列及旁侧序列，也未有此转化事件特异性定性PCR检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法。该PCR方法能够利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因番木瓜55-1。

本发明首先提供了一种转基因番木瓜55-1转化事件外源插入载体旁侧DNA片段，其碱基序列如SEQ.NO.1所示，由来源于番木瓜基因组序列的第1至1432碱基和来源于外源载体序列的第1433至3780个碱基共同组成。 

本发明还提供了一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法，所述方法是根据SEQ NO.1所示的序列（番木瓜Carica papaya L.papaya, pawpaw, tree melon ）设计特异性引物，PCR反应中的正向引物依据SEQ NO.1中1-1432个碱基序列设计，反向引物依据SEQ NO.1中1433-3780个碱基序列设计，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品含有转基因番木瓜55-1转化事件来源的成分；若扩增未获得目的片段，则待测样品不含有转基因番木瓜55-1转化事件来源的成分。

所述特异性引物如下：

55-1-F:5’- ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’

55-1-R:5’- TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3’，

       所述目的片段长度为 275 bp。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.      本发明首次公布转基因番木瓜55-1转化事件外源插入基因组位点的旁侧序列信息；