[发明专利]一种重组L-阿拉伯糖异构酶及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)及其基因和制备方法，以及利用该酶制备D-塔格糖(D-tagatose)的方法。

背景技术

塔格糖是一种在自然界中存在较少的单糖，在苔藓、地衣等低等植物以及加热过的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中有少量存在。塔格糖是一种己酮糖，其甜度为蔗糖的92％，而热量值只有1.5kcal/g。纯净的塔格糖为白色无水晶体物质，无臭，熔点134℃。

塔格糖具有良好的功能特性，如糖尿病人食用后可以抑制和减缓血糖的升高；在加热和烘烤过程中发生美拉德反应，产生良好色泽，可以作为蔗糖的替代品或和其它甜味剂复配使用；进入结肠后，被其中的微生物菌群选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌生长，明显改善肠道菌群，是一种很好的益生素。大量的安全毒理学试验表明，塔格糖安全无毒，因此被美国FDA批准为GRAS(generally regarded as safe)，目前被允许作为甜味剂加入食品、饮料、保健品等中。

塔格糖的生产方法包括天然提取分离法、化学催化合成法以及生物转化法等。塔格糖是一种较为罕见的单糖，在自然界的含量极低，提取分离成本高，不适宜工业化大生产。化学催化法也存在许多不利的因素，如化学污染物多，副产物多，分离困难等。因此，近年来对塔格糖生产的研究主要集中在生物转化法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，L-arabinose isomerase，L-AI)可以催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-塔格糖的工业化生产要求L-阿拉伯糖异构酶的最适反应pH最好在5.0～6.0之间，最适反应温度最好在60～80℃之间，这有利于提高反应速度，减少非特异性反应，避免褐变反应。然而，目前报道的天然L-阿拉伯糖异构酶无法同时在pH和温度等方面满足工业化生产的要求。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对天然L-阿拉伯糖异构酶无法同时在pH和温度等方面满足生物转化法生产D-塔格糖的要求，提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶及其基因和制备方法，以及利用该酶制备D-塔格糖的方法。

本发明的第一方面是提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶，它的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明第二方面提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶基因，它的核苷酸序列是以下的任何一种：

1)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示蛋白的核苷酸序列。

本发明中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长1488，编码496个氨基酸，所用密码子有利于该基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达。

本发明中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白为L-阿拉伯糖异构酶。所有编码该氨基酸序列的核苷酸序列都在本发明的范围之内。

本发明的第三方面是提供含有如上所述的重组L-阿拉伯糖异构酶的重组载体。所述的重组载体所用的载体是本领域的常规载体，包括克隆载体和表达载体。较佳的如克隆载体pUC57。也可以是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，较佳的如穿梭载体pMA5。

本发明的第四方面是提供含有如上所述的重组载体的转化子。所述的转化子的宿主细胞是本领域常规的宿主细胞，如大肠杆菌，优选枯草芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌WB600。该转化子较佳的是表达重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，优选枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌WB600。

本发明的第五方面提供一种制备表达重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的方法，包括以下步骤：

1)合成氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的L-阿拉伯糖异构酶的基因；

2)将步骤1)的L-阿拉伯糖异构酶的基因克隆入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体中构建重组载体，然后将重组载体导入枯草芽孢杆菌表达菌株获得重组枯草芽孢杆菌，即得表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。