[发明专利]一种检测埃博拉病毒的荧光定量PCR检测方法及其引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种埃博拉病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。

背景技术

埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever，EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的，主要以人和非人类灵长类动物为易感动物的急性出血性传染病。该病1976年首次发生于埃博拉河流域的刚果民主共和国(前扎伊尔)，因感染者全身呈出血症状，故命名为埃博拉出血热。据推测最初人类感染EBOV主要是因为人类接触感染了病毒的动物宿主或者间接宿主的身体。在这之后人与人之间通过直接接触已经感染了病毒的人的身体进行传播。在经历一段2-21天的潜伏期之后，感染病毒的病人就会出现一些发热的症状。EHF的主要特征是迅速发热，寒冷，头痛和肌肉疼痛，之后会产生咽喉肿痛，恶心，呕吐，腹泻以及腹痛。大约一半的病人会出现出血症状，例如从鼻孔出血，出现血尿或者是胃肠出血和阴道出血。EHF目前为止主要呈现地方性流行，绝大部分集中于非洲。非洲以外地区偶有病例报道，均属于输入性或实验室意外感染，未发现有EHF流行。EBOV已经被证实是通过体液传播的，如口腔和结膜接触传播，这在非人灵长类动物试验已确证。自然界的动物各种行为和其它因素都有可能造成EBOV的爆发。为了防止EBOV进入我国，对我国的经济以及人身安全造成严重的损失，目前我国急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。

EHF的病原是EBOV，属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属(Filovirus)成员，是非分节段的单股负链RNA病毒。目前已鉴定的埃博拉病毒有5种亚型，分别是：EBOV-扎伊尔型(Ebola-Zaire，简称EBOV-Z)，EBOV-苏丹型(Ebola-Sudan简称EBOV-S)，EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo，简称EBOV-B)，EBOV-科特迪瓦型(Ebola-Ivory Coast，简称EBOV-C)，EBOV-莱斯顿型(Ebola-Reston，简称EBOV-R)。感染EBOV-Z，EBOV-S和EBOV-B的致死率大约在25％-90％。EBOV属于我国必须严密监控其传播入我国的急性烈性外来人兽共患传染病，建立一种敏感、特异的，能够同时检测EBOV5种亚型病毒的检测方法对我国EBOV的防控工作具有重要意义。

荧光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特点，SYBR Green I荧光定量PCR利用SYBR Green I能结合到双链DNA的小沟部位放出荧光的方法广泛应用于核酸的特异性检测。在EBOV的检测方法研究领域，IgG-捕获ELISA和IgM-捕获ELISA是仅有的两类常用检测方法，建立一种敏感、特异的，同时针对5种亚型EBOV的荧光定量PCR方法更具有重要的实践意义。

经对现有技术的文献检索发现，国内没有EBOV检测技术的专利公布。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对没有EBOV荧光定量PCR检测技术的问题，提供一种EBOV 5种亚型的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。该方法检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检测小于2个小时，操作简易，可以进行高通量的样品检测。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明的技术方案一为，一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子，所述的遗传标记分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中连续的50-273个核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中连续的50-196个，优选196bp个核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范围内的核苷酸片段都是本发明保护的检测埃博拉病毒的遗传标记。

优选的，所述的遗传标记分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。

更优选的，所述的遗传标记分子是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5所示序列的核苷酸。