[发明专利]用于检测小苍兰病毒的引物及其检测方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种用检测植物病毒的引物及其方法，尤其涉及一种用于检测小苍兰病毒的引物及其检测方法。

【背景技术】

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、小苍兰花叶病毒(Freesia mosaic virus，FreMV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害小苍兰的三种主要病毒。

在田间这几种病毒常常复合侵染，造成小苍兰花色杂，花朵数量骤减，植物生长不良，严重影响其观赏价值，发病严重时，甚至造成种球的退化，失去再利用的价值，这几种病毒的复合侵染已经成为小苍兰大规模生产的主要限制因素。目前，小苍兰病毒尚无特别有效的化学防治方法，培育和栽培无病毒苗成为防治小苍兰病毒的根本措施，在无毒苗培育过程中，经常需要对母本及脱毒苗进行病毒检测。

目前，植物病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术(即ELISA方法)，但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳性反应、检测灵敏性相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR技术的病毒检测技术正在迅速发展，但单重PCR检测技术，一个反应只能检测一种病毒，若应用于田间多种病毒复合侵染的小苍兰病毒的检测，则存在着耗时、耗力、费用高的问题。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种用于检测小苍兰病毒的引物，可将小苍兰叶片中的CMV、FreMV和BYMV 3种病毒同时扩增出三个特异性片段。

本发明所要解决的技术问题之一是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种用于检测小苍兰病毒的引物，包括针对小苍兰中的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因设计的黄瓜花叶病毒引物对，针对小苍兰中的小苍兰花叶病毒的外壳蛋白基因设计的小苍兰花叶病毒引物对，以及针对小苍兰中的菜豆黄花叶病毒的外壳蛋白基因设计的菜豆黄花叶病毒引物对；其中，所述各引物对具体为：

(1)黄瓜花叶病毒引物对：黄瓜花叶病毒的正向引物5′-AATCTGAATCAACCAGTGCTGG-3′，黄瓜花叶病毒的反向引物5′-GTGGGAATGCGTTGGTGCTC-3′；

(2)小苍兰花叶病毒引物对：小苍兰花叶病毒的正向引物5′-GACGAGGTGCGATACCAAGCAACC-3′，小苍兰花叶病毒的反向引物5′-GCACTCCATTGAACCAGGCGTC-3′；

(3)菜豆黄花叶病毒引物对：菜豆黄花叶病毒的正向引物5′-AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3′，菜豆黄花叶病毒的反向引物5′-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3′。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种利用所述的引物检测小苍兰病毒的方法，实现了一次反应就能同时检测出3种小苍兰病毒即CMV、FreMV和BYMV的目标，具有检测效率高、成本低、灵敏度高的优点。

本发明所要解决的技术问题之二是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种利用所述的引物检测小苍兰病毒的方法，包括以下反应体系和反应程序：

反应体系：反应体系的总体积为50μL，含有0.3μL 5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL 2.5mmol/L的dNTPs、1μL模板、0.3-0.38μmol/L的黄瓜花叶病毒正向引物、0.3-0.38μmol/L的黄瓜花叶病毒反向引物、0.02-0.04μmol/L的小苍兰花叶病毒正向引物、0.02-0.04μmol/L的小苍兰花叶病毒反向引物、0.02-0.07μmol/L的菜豆黄花叶病毒正向引物、0.02-0.07μmol/L的菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述黄瓜花叶病毒正向引物、黄瓜花叶病毒反向引物、小苍兰花叶病毒正向引物、小苍兰花叶病毒反向引物、菜豆黄花叶病毒正向引物、菜豆黄花叶病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积50μL为基准；

反应程序：A.94℃预变性5min；94℃变性30s，52-58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；B.72℃延伸10min；C.4℃终止反应。