[发明专利]高通量的RSV蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒滴度的定量检测法，特别是涉及一种用于药物筛选及生物样品检验的RSV(Respiratory Syncytial Virus，呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其高通量检测试剂盒。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)是在婴儿时期和儿童早期导致支气管炎和肺炎的主要原因。该病毒通常会引起再感染。再感染一般发生在成年人中。在老人和缺乏免疫力的病人当中，可能导致下呼吸道的严重疾病。通常病情会持续两到三周.在婴儿和有高风险病情的儿童中，RSV(呼吸道合胞病毒)感染可能会危及患者的生命。病毒性支气管炎是一个严重的传染病，据估计每年引起100万人死亡，其中大多数病例是由RSV(呼吸道合胞病毒)引起的。出生后第一年，高达70％～80％比例的婴儿将感染RSV(呼吸道合胞病毒)。目前尚无有效的疫苗或小分子药物用来防治RSV(呼吸道合胞病毒)感染。因此，用快速、高效的方法来筛选获得抗RSV(呼吸道合胞病毒)的有效药物是研发新药的有效手段。

在抗病毒药物筛选方法中，目前主要使用细胞病变效应(CPE)法。其检测方法有四甲基偶氮唑盐(以下简称MTT)法，或者使用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)进行检测。其中，MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。而CCK-8试剂盒是基于WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐】的检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系，即生成的甲臜量与活细胞数量成正比。但这些CPE法灵敏度低，通量亦不适于大量化合物的筛选。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测抗原，后者用于测定特异性抗体。ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，具有适宜于大规模筛查试验、又可以用于少量标本的检测、既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，因此，具有广泛的使用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒。本发明改变了目前筛选抗病毒药物的方法，提高了筛选通量，缩短了筛选周期(可以缩短60％以上的时间)，同时该方法也用于临床或非临床样品的定量检测。

为解决上述技术问题，本发明的用于高通量药物筛选及生物样品检验的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量检测法，包括步骤：

A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Hep2细胞的培养阶段、RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；

B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。

所述非临床样品包括：化合物；临床样品包括：患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；临床前样品包括：动物模型组织提取物等。

所述A中的Hep2细胞的培养阶段，步骤包括：

①将Hep2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37℃、5％CO₂、培养16-24小时；

②待检测样品(非临床样品，如化合物)加入上述接种有细胞的培养板中；

③加入RSV(呼吸道合胞病毒)至上述培养板中；

④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。

所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50μl；