[发明专利]高通量的RSV蛋白含量的定量检测法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于高通量药物筛选及生物样品检验的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量检测法，包括步骤：

A、对于非临床样品，其检测步骤，包括Hep2细胞的培养阶段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤；

B、对于临床或临床前样品，其检测步骤，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量检测阶段步骤。

2.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于：所述非临床样品包括：化合物；

临床样品包括：患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；

临床前样品包括：动物模型组织提取物。

3.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于：所述A中的Hep2细胞的培养阶段，步骤包括：

①将Hep2细胞接种至细胞培养板中培养；其中，培养条件为37℃、5％CO₂、培养16-24小时；

②将非临床样品加入上述接种有细胞的培养板中；

③加入呼吸道合胞病毒RSV至上述培养板中；

④培养板经培养96-120小时后，取细胞培养上清进行ELISA检测。

4.如权利要求3所述的定量检测法，其特征在于：所述细胞培养板是384孔培养板，接种的细胞密度控制在每孔1800-3000个细胞，体积为20-50μl；

所述培养阶段③中，加入呼吸道合胞病毒RSV的量为：50-150倍TCID₅₀病毒稀释液，体积为10-40μl。

5.如权利要求1所述的定量检测法，其特征在于：所述A、B中的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测阶段，步骤包括：

①在384孔酶标板内加入羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤后，加入封闭试剂作用，然后洗涤；

②在384孔酶标板内加入待测样品经孵育、洗涤后，加入生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体，经孵育、洗涤；

③在384孔酶标板内加入抗生物素过氧化蛋白酶，经孵育、洗涤后，加入TMB显色液作用后，再加入TMB终止液；

④在450nm波长处测量酶标板的吸光值。

6.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于：所述ELISA检测阶段中，所涉及的所有洗涤是使用PBS-Tween 20洗涤3次以上；

所述ELISA检测阶段的步骤①中，羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体加入量为：羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的1∶480-1∶2000倍的稀释液，每孔加入30-70μl，孵育的条件为：37℃孵育1-3小时；

封闭试剂为0.5％-2％的BSA，加入的量为每孔100-120μl，4℃过夜或者37℃孵育2-4小时。

7.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于：所述ELISA检测阶段的步骤②中，待测样品包括：细胞培养上清，临床或临床前样品；

待测样品的加入量为10-50μl，待测样品孵育的条件为：25℃过夜或者37℃孵育1-3小时；

生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的加入量为：生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体的1∶2000-1∶10000倍的稀释液，每孔加入30-70μl，孵育的条件为：37℃孵育1-3小时。

8.如权利要求5所述的定量检测法，其特征在于：所述ELISA检测阶段的步骤③中，抗生物素过氧化蛋白酶的加入量为：抗生物素过氧化蛋白酶的1∶1000-1∶4000倍的稀释液，每孔加入30-70μl，孵育的条件为：37℃孵育20-40分钟；

TMB的加入量为每孔30-60μl，常温作用2-15分钟；

TMB终止液的加入量为每孔30-60μl。

9.如权利要求1所述的一种应用于高通量药物筛选及生物样品检验的定量检测试剂盒，其特征在于：所述定量检测试剂盒包括：呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测试剂。

10.如权利要求9所述的定量检测试剂盒，其特征在于：所述定量检测试剂盒，还包括：Hep2细胞、呼吸道合胞病毒RSV、384孔酶标板；

所述呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA检测试剂包括：羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体、生物素结合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗体、抗生物素过氧化蛋白酶、封闭试剂、洗涤液、TMB显色液、TMB终止液。