[发明专利]截短侧耳素产生菌的微量培养方法和其高产菌的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及截短侧耳素产生菌的微量培养方法和其高产菌的高通量筛选方法。

背景技术

截短侧耳素类衍生物有沃尼妙林、泰妙菌素等，主要作为预混剂添加于动物饲料中，不仅有预防猪疟疾和肺炎的作用，还可以增加肉猪产量。截短侧耳素类抗生素在生产实践中的作用日渐突出，其发酵研究也逐渐成为研究热点，为了提高发酵产量，选育高产菌株是截短侧耳素类抗生素应用的突破点。

目前高通量的微生物微量培养和检测方法正逐步成为菌种筛选的主要方式，但各种微生物的微量培养方法不同，针对截短侧耳素产生菌的一类高等担子真菌的微量培养方法还没有被完善的建立起来；快速检测技术主要是基于高通量的酶标仪光学检测，但有效、快速、准确的针对截短侧耳素类抗生素等二萜烯类物质的微量检测方法也未见报道。

将酶标仪检测技术应用于高通量的高产菌种筛选的关键在于，产物出现稳定的特征吸收峰以及产物高效的转板问题。只有将微量培养和酶标仪检测相结合才能够很好的解决这一问题，而目前的微量培养以及高通量检测技术均不适用于截短侧耳素产生菌一类的高等担子真菌，以及其特殊的二萜烯类结构。

发明内容

本发明提供一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法，本发明还提供截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法。

为了实现上述目的本发明提供一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法，所述微量培养方法的步骤如下：

1）、将截短侧耳素产生菌稀释成菌悬液，涂布于平板，培养后分离单菌落；

2）、配制固体发酵培养基：以下为质量百分含量：葡萄糖5.7%、玉米浆4%、大豆油0.4%、MgSO₄0.04%、大豆蛋白胨1%、琼脂粉1.5%，其余为水；

3）、将步骤2）中的固体发酵培养基高压灭菌后在无菌环境中将其加入酶标板，每孔加入量为孔体积的1/3-2/3； 

4）、将步骤1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体接种于步骤3）中制备的酶标板中，于25℃培养7-9天，完成截短侧耳素产生菌的微量培养。

进一步地，步骤3）中所述固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/2。

本发明还提供一种截短侧耳素高产菌的高通量筛选方法，所述高通量筛选方法的步骤如下：

1） 将截短侧耳素产生菌稀释成菌悬液，涂布于平板，培养后分离单菌落；

2）、配制固体发酵培养基：以下为质量百分含量：葡萄糖5.7%、玉米浆4%、大豆油0.4%、MgSO₄0.04%、大豆蛋白胨1%、琼脂粉1.5%，其余为水；

3）、将步骤2）中的固体发酵培养基高压灭菌后在无菌环境中将其加入酶标板，每孔加入量为孔体积的1/3-2/3；

4）、将步骤1）中形成的截短侧耳素产生菌的单菌落菌丝体接种于步骤3）中制备的酶标板中，于25℃培养7-9天；

5）、在步骤4）的每孔中加入50-100μl甲醇或乙醇提取；

6）、每孔吸取一定量提取液，转板于另一酶标板中；

7）、向每孔加入浓硫酸显色，所述浓硫酸的体积大于等于提取液的体积；

8）、将每孔稀释相同倍数，吸取稀释液转板于另一酶标板中，在450nm-460nm波长处进行酶标仪的紫外吸收测定，分析测定结果，得到筛选后的截短侧耳素高产菌。

进一步地，步骤3）中所述固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/2。

进一步地，步骤7）中所述浓硫酸的体积与提取液的体积相同。此时可保证截短侧耳素在显色充分的同时浓硫酸用量最少。

进一步地，步骤8）中的稀释倍数为10-100倍。此时可以保证稀释后的提取液浓度在酶标仪的检测范围内。

进一步地，步骤8）中在455nm波长处进行酶标仪的紫外吸收测定。

进一步地，步骤5）中提取时间为5-20分钟。

进一步地，步骤5）中提取时间为10分钟。

本发明的技术方案的技术效果如下：

1.     提供了一种截短侧耳素产生菌的微量培养方法。由于高通量单菌落转接培养，各个孔间没有交叉影响，并且菌落生长环境高度一致，营养条件受到制约，在这种情况下，产量高低完全取决于菌种本身的遗传基因。

2.     由于采用固体发酵技术，发酵过程简化，静止培养过程中不需要过多调整培养基等条件，使各个单菌落间培养条件在整个发酵过程中保持一致，减少了人为操作等处理带来的误差。固体发酵培养基的每孔加入量为孔体积的1/3-2/3时，既可以保证菌体足够的生长营养需要，又留有足够的空间，保证氧气供应。