[发明专利]一种猪TLR4基因单核苷酸多态性的检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及猪TLR4基因单核苷酸多态性的检测方法，属基因工程技术领域。用此方法，能快速检测到猪TLR4基因的单核苷酸碱基突变，为猪免疫防御系统受体基因分子结构、功能研究提供帮助。

(二)背景技术

Toll样受体(TLRs)作为重要的模式识别受体，通过对病原体相关分子模式(PAMPs)的识别及信号级联反应，介导机体的天然免疫和获得性免疫，是机体抵抗感染的第一道屏障；TLRs基因变异导致宿主对革兰阳性菌、阴性菌的反应能力丧失，改变机体对病原的抗性或易感性。

TLR4在病原微生物跨膜信号传导具重要作用，研究已证实TLR4是机体对LPS免疫应答的主要受体，敲除该基因的小鼠对细菌性病原的刺激应答明显减弱，TLR4基因缺陷小鼠对病毒的抵抗能力降低。

目前有关猪TLR4基因的SNP检测偶见报道，但基本局限在个别外显子的单个碱基突变。本发明根据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计引物，对中外不同品种猪TLR4基因整个编码区进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并分析碱基突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，为猪Toll样受体与机体免疫力的关系研究奠定基础，同时，为猪抗病育种研究提供基因工程技术帮助。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供猪TLR4基因单核苷酸多态性检测方法，有助于研究猪TLR4基因的分子结构、功能及机体抗病原免疫模式和机理，为猪疫病防控及抗病育种提供依据。

技术方案

猪TLR4基因单核苷酸多态性的检测方法，包括：

设计猪TLR4基因序列特异性扩增引物，对猪模板cDNA进行PCR扩增；分离、纯化特异性扩增产物进行核酸序列测定、比对，找寻不同检测个体TLR4基因存在的单核苷酸碱基突变，分析基因突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、功能的改变。其特征在于如下步骤：

步骤一，据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计特异引物：

正义引物5′-CAATCAGTTGGTTTTGGGAGA-3′

反义引物5′-CACTTCTAAGTGTTGCCACCTG-3′

应用上述引物对待检测猪模板cDNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系(12μl)：10×PCR buffer 1.2μl，2mM/L dNTPs 1.2μl，25mM/L MgCl₂0.8μl，10pmol/μl primer 1.0μl，5U/μl Taq polymerase 0.2μl，50ng/μl DNA 0.8μl，ddH₂O 6.8μl；

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸8min；

其中，PCR扩增片段长度为247bp。

步骤二，对特异性扩增产物进行分离、纯化，获得特异核酸；

步骤三，对分离纯化的扩增产物进行序列测定、比对分析，检测出猪TLR4基因是否存在G960A或G962A单核苷酸碱基突变。

有益效果

本发明根据GenBank数据库猪TLR4基因序列设计引物，对中外不同品种猪TLR4基因整个编码区进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并为猪Toll样受体与机体免疫力的关系研究奠定基础，同时，为猪抗病育种研究提供基因工程技术帮助。

本发明通过研究，确定了检测猪TLR4基因编码区G960A、G962A碱基突变合适的特异引物SEQ ID NO：1-2，优化的PCR扩增程序和条件，明确了猪TLR4基因有效的单核苷酸突变碱基及相应的编码氨基酸改变，分析碱基突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，为TLR4受体基因遗传变异导致分子结构及功能变化提供理论依据，同时，为TLR4作为免疫模式受体基因发生变异而引起机体对部分传染性疾病免疫能力的改变等研究提供技术支持。

(四)附图说明

图1：PCR扩增产物PAGE电泳示例

图2：突变点测序结果示例

(五)具体实施方式

本发明针对猪TLR4基因编码区的筛查，检测到猪该基因存在G960A、G962A两处单核苷酸碱基突变，引起Arg321His编码氨基酸的改变。

针对猪TLR4基因碱基突变的检测技术较多，包括DNA直接测序、杂交测序、酶切测序、DNA芯片技术、变性高效液相色谱等。较常规简易的实施方式为：