[发明专利]表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系及其建立方法

说明书

技术领域

  本发明涉及表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系，其含有编码牛γ干扰素的基因。该细胞系分泌的牛γ干扰素具有极高的比活力和稳定性，可用作牛感染性疾病的临床治疗和相关诊断方法的研究。

背景技术

γ干扰素（IFN-γ）主要是由被有丝分裂原或特异性抗原刺激而活化的CD4⁺ Th1细胞、CD8⁺ T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，如活化巨嗜细胞、提高MHCⅠ类和Ⅱ类分子的表达、促进抗原提呈等，是机体防御系统的重要组成部分。研究表明外源性的IFN-γ既可以作为药物用于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果；内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。

牛γ干扰素基因在正常情况下处于封闭状态，必须在各种特异性或非特异性刺激因子的刺激下才能表达，利用传统的方法从牛血液中提取和纯化牛γ干扰素，过程繁琐且含量很低，无法满足实际使用的需求，因此要获得高效价廉的牛γ干扰素，须通过基因工程技术大量制备和生产，使其在动物中的应用成为可能。大肠杆菌表达系统表达的牛γ干扰素蛋白不能进行翻译后的修饰等过程，因此其空间结构及生物活性与天然抗原有较大差别；多以包涵体或部分可溶的形式存在，使其纯化复性困难；还有内毒素难以去除等诸多缺陷，因此在临床应用中受到一定程度的限制。杆状病毒载体表达系统在病毒感染后期，由于细胞裂解，胞内物质的释放会导致目的蛋白的纯化困难；释放的一些水解酶也会降解重组蛋白；加工修饰体系与哺乳动物细胞也存在一定差异。哺乳动物细胞表达的牛γ干扰素与其他表达系统相比，可以对γ-干扰素蛋白进行正确的折叠加工及糖基化、二硫键的修饰，因此比活性更高，稳定性更好，为Ⅱ型干扰素相关的理论研究、临床应用及诊断方法的研究提供了重要的生物材料，具有重要的基础研究和实际应用意义。

本研究利用Flp-In-293为稳定转染宿主细胞系，该细胞系含有一个位于转录活性基因座的FRT位点。带有单一FRT位点的真核表达质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG与Flp重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞，在Flp重组酶介导下真核表达质粒与细胞系中的FRT位点发生Flp/FRT位点特异性重组，可使BoIFN-γ基因整合到细胞基因组中相同的活性转录染色质区，在SV40早期启动子和起始密码子ATG的控制下得以表达。

发明内容

本发明的目的是建立高效稳定表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系。

本发明所述的细胞系，是以Flp-In-293为宿主细胞，在Flp-In-293细胞FRT位点通过Flp/FRT位点特异性重组，使BoIFN-γ基因整合到Flp-In-293细胞基因组中而获得。所以本发明所述的表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系，是含有编码牛γ干扰素基因BoIFN-γ的Flp-In-293细胞系，命名为B1。

本发明所述的细胞系B1，还可以在所述编码牛γ干扰素的基因之前加入Kozak序列。

本发明所述的细胞系通过以下方法建立：

本发明根据Flp-In^TM 系统，将牛γ干扰素的开放阅读框（ORF）基因克隆至真核稳定表达载体pcDNA5/FRT，与重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞，经Hygromycin B抗性筛选和亚克隆，获得可稳定表达重组牛γ干扰素的Flp-In-293细胞克隆B1。本发明中细胞系B1分泌表达的重组牛γ干扰素具有近似天然牛γ干扰素的空间结构与生物活性，具有重要的基础研究和实际应用价值。

附图说明

图1. 重组质粒pCR2.1-preBoIFN-γ双酶切鉴定图

1．λ-EcoT14 DNA 标记；2．DL2000 DNA 标记；3．KpnⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定pCR2.1-preBoIFN-γ。

图2. 重组质粒pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG双酶切鉴定图

1．λ-EcoT14 DNA 标记；2．DL2000 DNA 标记；3．KpnⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG。