[发明专利]焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，尤其涉及一种使用焦磷酸测序方法从痰标本中直接检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药突变的引物和检测方法。

背景技术

异烟肼（NH）作为一种高效特异的抗结核药物，它主要通过结核杆菌内过氧化氢-过氧化物酶（由KatG基因编码）的作用下才能转化为活性形式作用于enoyl-ACP还原酶，抑制杆菌酸和细胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活异烟肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然会造成结核菌异烟肼耐药性，进一步的研究发现造成临床异烟肼耐药性的主要原因不仅是KatG基因的完全缺失、点位突变、碱基的插入和缺失同样重要。

目前，前期建立的焦磷酸测序结核杆菌异烟肼耐药性检测方法是从结核分枝杆菌痰标本培养物中进行检测，但结核杆菌分离培养的过程至少需时1月，严重制约了分子生物学检测手段快速的优越性，如果能从痰标本中直接进行耐药性检测，则可以大大缩短药敏结果的时间，对临床指导价值更大。但由于痰标本中所含菌量远远低于痰标本纯培养物，用以前的方法仅进行一轮PCR扩增，所得PCR产物浓度过低，远远达不到焦磷酸测序检测的要求，无法实现在痰标本中的检测。

中国专利CN1311435披露了一种结核分支杆菌耐药性检测芯片，其中在一经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针。在检测芯片中所说的探针是针对rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因，每个探针长度至少为10个碱基，并且各个探针长度相同；突变点尽可能位于探针中间。

在《中华检验医学杂志》2011年 第2期中刊登了“焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性”一文，其中利用焦磷酸测序技术以10株已知药敏结果和经直接测序已知耐药基因突变情况的MTB为试验菌株，摸索焦磷酸测序检测MTB  rpoB、katG、gyrA、rrs耐药基因的最佳模式，并用该条件检测89株MTB临床分离株，并将检测结果与BACTEC 960药敏法进行比较，以便得到最佳的检测方法。

在现有常规检测结核分枝杆菌耐药性的方法中，都不可以避免需要事先对患者痰标本进行分离培养结核分枝杆菌菌株，这就使得检测时间增长，检测中需要进行反应的次数也比较多，使得不能快速得出耐药性的结果。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用焦磷酸测序方法从痰标本中直接检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药突变的引物和检测条件。

为了实现上述本发明提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法，包括以下顺序步骤：

步骤1，对KatG基因进行PCR扩增；

步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断KatG基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SNP模式、核苷酸加样顺序为GTCACAGTCTG。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，其中针对KatG基因315位点进行焦磷酸测序并设计引物。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，所述对KatG基因进行PCR扩增进行两次PCR扩增，其中第一次扩增以痰标本结核杆菌DNA提取物为模板，第二次扩增以第一次扩增PCR产物为模板。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，其中第一次扩增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，所述第二次扩增使用的第二PCR引物具有SEQ ID NO.3所示序列或带有生物素标记的具有SEQ ID NO.2所示序列。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，其中所述第一PCR引物和第二PCR引物的浓度为0.4 μml/L。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，其中在焦磷酸测序中用的测序引物具有SEQ ID NO.4所示序列。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法中，其中所述扩增反应过程包括下列顺序步骤：

步骤1：在94℃下进行预热5分钟；

步骤2：在95℃下保持30秒进行变性、61℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，循环退火过程40次；

步骤3：在72℃下保持10分钟。

本发明提供的检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，无需再做分离培养结核分歧杆菌菌株，相比现在常用检测方法可以缩短检测时间，减少焦磷酸序列测定所需要的反应次数和检测试剂用量。

附图说明