[发明专利]RNAi转基因植物的快速精确检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检查技术，特别是RNAi转基因植物的快速精确检测方法。

背景技术

随着转基因植物商品化的逐渐扩大，转基因作物种植面积的快速增加，鉴于目前对转基因产品释放所带来的安全性问题的担忧，因此对转基因产品的检测技术提出了更高的要求。目前针对转基因产品的检测技术主要分为两类，分别基于核酸和蛋白质。针对外源蛋白进行检测的技术主要包括：血清学检测、试纸条法和western杂交法。但由于外源蛋白表达量占植物总蛋白表达量较低，且蛋白易降解，因此相对于蛋白而更稳定的核酸成为检测的首选。

RNAi技术是通过对植物固有基因进行干涉、引起基因沉默，从而实现植物改良的目的。由于没有导入外源目的基因，常用的针对目的基因的检测方法，无法有效地应用于对RNAi转基因植物的检测。因此，根据RNAi载体构建特点，研发针对RNAi转基因植物特异的检测技术，有助于弥补现有转基因检测技术的不足，对于转基因植物的精确检测和有效监管具有十分重要的意义。

发明内容

根据上述领域的需求和空白，本发明提供一种检测RNAi转基因植物的方法。

RNAi转基因植物的快速精确检测方法，步骤如下：

(1).提取待检测植物的基因组DNA，

(2).进行PCR扩增，

(3).取部分PCR扩增产物进行变性/复性处理，

(4).以原PCR扩增产物为对照，对进行变性/复性处理后的PCR扩增产物进行凝胶电泳，观察变性-复性处理后PCR扩增产物的电泳迁移距离的是否比原PCR扩增产物的电泳迁移更远；

所述PCR扩增中采用的引物，其正向引物为：

CaMV 35S启动子AGAACTCGCCGTAAAGACT，

Napin启动子TAGAGTTGGGTTGAATGAGAT，

和Ubi启动子TGCTCACCCTGTTGTTTG；

其反向引物为：

nosT  终止子AAATGTATAATTGCGGGACT，

ocsT  终止子CCGTAACTTTCGGTAGAGC，

和CaMV 3′UTR终止子CCAGATAAGGGAATTAGGGT。

所述多重PCR体系为：10×Buffer 2.5μL，dNTPs 200μM，Glycerol 5％，Primer F/R 0.2μM each，Template DNA 100ng，Taq DNA polymerase 1.25U，加ddH₂O至25μL

所述扩增程序为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，扩增36个循环，72℃延伸10mins。

所述变性-复性处理：变性94℃5mins；缓慢复性94℃～24℃，每降低5℃保持1min，室温放置                                15mins。

上述任一方法在检测RNAi转基因植物中的应用。

本发明首先根据RNAi转基因植物中转入的RNA干扰载体的发卡结构特点，提供了一种依赖于PCR扩增的检测方法以验证待测植物是否是RNAi转基因植物。该方法中，PCR扩增所用的引物为根据转基因事件中构建的载体常用的启动子和终止子进行设计的多重引物，本发明中PCR能扩增出条带并不能说明该植物是RNAi转基因植物，还须对PCR产物进行变性和复性处理。变性使PCR产物从互补的双链分开为单链，如果扩增产物来自于RNAi干扰载体，则该产物片段的单链内包含能形成发卡结构的正反向基因序列，因此，变性过程中产生的每一条单链会在复性过程中形成发卡结构即弯折为部分互补的双链，则变复性产物在凝胶电泳图中表现为迁移距离相对于原PCR产物更远。这种变复性处理后电泳迁移距离会发生变化的PCR产物所对应的待测植物，可以肯定是RNAi转基因植物。本发明实施例2通过一种RNAi转基因植物和一种非RNAi转基因植物验证本发明的检测方法。