[发明专利]近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物真菌的检测技术范围，具体涉及近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。

背景技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是针对靶序列上6个特异性位点，设计2对特殊的引物，并通过具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物。现已有技术将LAMP应用于巨细胞病毒，分枝杆菌，沙门菌，巴西副球孢子菌，非洲锥体虫等的检测。其特异性和高效性的关键在于靶基因的选择和引物的设计。

近年来，随着体内留置导管增多，光谱抗生素，免疫抑制剂，糖皮质激素，抗肿瘤化疗药物的广泛使用，及器官移植的广泛开展，真菌血流感染的比例随之增高，念珠菌血症占主导地位。公开号为CN101381775的中国专利申请(申请号：200810157907.3)公开了白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。而近平滑念珠菌的LAMP检测方法尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。

本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。

本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测试剂盒含有所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物以及环介导等温扩增反应试剂。

本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，对待检测样品经过培养后提取DNA，得DNA模板，利用权利要求1所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物进行环介导等温扩增，然后进行判读。

环介导等温扩增的反应体系中混合引物SEQ ID NO 1～4各序列的摩尔比为8∶8∶1∶1。

环介导等温扩增的反应体系组成如下：20mM pH8.8的Tris-HCl，10mM KCL，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，3.6μl混合引物，8U bstDNA聚合酶，1.5μl DNA模板，1.2mM dNTP，0.8M甜菜碱，加H₂O至20μl

可以通过浊度、SYBR green I荧光反应的颜色或琼脂糖凝胶电泳的条带形状进行判读。

利用本发明对近平滑念珠菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速的优点。

具体实施方式

本发明关键在于靶基因选择及引物设计。本发明的发明人选择近平滑念珠菌保守序列中的一段特殊序列作为靶基因，在GenBank中查询比对后确定其为近平滑念珠菌所特有。针对此序列，采用primerexplorer V3软件，进行引物设计。软件给出候选引物1000组。最终获得以下2对引物，引物序列为：

SEQ ID NO 1：

5’-GCCTACCAAAGCAAAGTTTTCAAAA-GAATGAAAAGTGCTTAACTGC-3’；

SEQ ID NO 2：

5’-GGCCTGCCAGAGATTAAACTC-CCGTTGTTGAAAGTTTTGAC-3’；

SEQ ID NO 3：

5’-TAGGTGAACCTGCGGAAG-3’；

SEQ ID NO 4：

5’-GATGCGAGAACCAAGAG-3’。

实验证实，使用该组引物检测近平滑念珠菌的特异性和敏感性均较好。

下面通过具体实施方式对本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法做进一步说明。

1.实验材料

(1)实验菌株的选择

实验菌株有已知近平滑念珠菌的标准菌株及经常规鉴定的念珠菌。并且采用本实验建立的方法对临床血培养瓶中的未知念珠菌进行了检测。

(2)试剂采购

bstDNA聚合酶来自New England Biolabs，甜菜碱来自Sigma公司，溶细胞酶来自Solarbio，引物的合成由生工生物工程有限公司完成。