[发明专利]双子叶植株转基因受体的快速制备方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种快速、稳定高效的双子叶植株(例如大豆)转基因用受体的制备方法，用于培育稳定的转基因株系；同时本发明利用相关受体材料开展大豆及其他双子叶植株转基因的程序。

背景技术

大豆(Glycine max L. Merrill)是属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n＝40)植物，是中国乃至全球重要的粮食作物和经济作物，是食用植物油、蛋白等的主要来源之一，在国内外市场占有十分重要的地位。然而，普通栽培大豆由于遗传基础相对狭窄，育种周期相对较长，且受各种病、虫害及各种非生物逆境的影响，仅靠常规育种手段培育的大豆的品质和产量难以满足国内外市场对大豆日益增长的需求。与此同时，借助分子生物学手段培育的转基因大豆被越来越多的人所接受。植物转基因技术作为一种新兴的生物技术手段，在抗性育种、提高产量和品质以及缩短育种周期等方面有着显著的优势。由此可见，通过遗传工程手段可为传统的大豆育种提供新的思路和方法。

利用遗传转化技术将有功能的目的基因转入大豆基因组需要一种快速有效地转基因整合和转化植株的再生的方法。现在全世界应用最多的两种转化大豆的方法，一种是利用基因枪轰击大豆不成熟胚，这种方法需要很长时期培养组织；另一种方法是根癌农杆菌介导的转化大豆组织，例如胚轴、从萌发种子中分离的不成熟子叶或子叶节组织。早前报道，农杆菌介导转化大豆子叶节法产生的转基因大豆，这种方法需要在发芽5-7天的大豆幼苗的子叶节位置进行精细的致伤(Clemente et al.，2000；Olhoft & Somers，2001；Olhoft et al.，2003；Paz et al.，2004；Zhang et al.，1999 & 2000)。这种方法不仅步骤烦琐、周期较长，而且由于受体材料在制备过程中受到操作者技术的影响，重复性较差；同时相对较长的培育期也造成受体材料中细胞有5天的发育期，因而细胞的被转化效率明显下降，转化后嵌合体比例增加。

上述参考文献具体如下：

1.Clemente T， LaValle BJ，Howe AR，Ward DC et al.(2000)Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-mediated transformation.Crop Sci 40：797-803(Clemente T， LaValle BJ，Howe AR，Ward DC et al.(2000)农杆菌介导法抗草甘膦转基因大豆的后代分析.美国作物科学杂志40：797-803.)。

2.Olhoft PM，Somers DA(2001)L-cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNAdelivery into soybean cotyledoanry-node cells.Plant Cell Rep.20：706-711(Olhoft PM，Somers DA(2001)L半胱氨酸提高农杆菌介导的大豆子叶节转基因T-DNA插入效率.植物细胞通讯.20：706-711.)。

3.Olhoft PM，Flagel LE，Donovan CM，Somers DA(2003)Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method.Planta216：723-735(Olhoft PM，Flagel LE，Donovan CM，Somers DA(2003)利用潮霉素筛选的高效大豆子叶节转基因方法.植物杂志216：723-735.)。

4.Zhang Z，Xing A，Staswick P，Clemente T(1999)The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean.Plant Cell Tiss Org Cult 56：37-46(Zhang Z，Xing A，Staswick P，Clemente T(1999)利用草丁膦进行筛选的农杆菌介导的大豆转基因方法。植物细胞、组织和器官培养.56：37-46)。