[发明专利]一种制备右旋糖酐的右旋糖酐糊精酶

说明书

技术领域

本发明属于右旋糖酐生产制备技术领域，具体涉及一种从氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)胞内分离纯化的右旋糖酐糊精酶，及其制备方法和主要的酶学性质。

背景技术

右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是一种由葡萄糖单元脱水形成的高分子聚合物，它的结构具有多样性，通常被定义为一种完全由α-D-吡喃葡萄糖单体构成的多糖。右旋糖酐是某些细菌产生的一种胞外多糖，是由分泌性酶催化生成的胞外产物，作为最早发现的微生物多糖，右旋糖酐是美国FDA(食品和药物管理局)批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖，也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖。右旋糖酐因其安全、无毒、生物相容性好等优点，被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域。

右旋糖酐的生产包括有如下两种方法：微生物直接发酵法和酶合成法，而工业生产上主要以直接发酵法为主。但直接发酵法生产葡聚糖时，产物分子大小难以控制，发酵后菌体与产品很难分离，生产中引入的氮、氯等杂质，致使右旋糖酐质量低，临床副反应多。而利用诱导分离出的葡聚糖合成酶来制备右旋糖酐可以克服这些不足，因此，从特有的微生物中通过分子生物学技术构建和筛选的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重点之一。

Hehre和Hamilton等在研究中发现来源于G.oxydans中的某种酶能够利用麦芽糊精和淀粉部分水解物合成右旋糖酐，这种酶被命名为右旋糖酐糊精酶(DDase)。该酶可催化形成只含有α-1，6和α-1，4-糖苷键的右旋糖酐，该右旋糖酐与利用肠膜明串珠菌制备的右旋糖酐相比，粘度和含热值较低，且具有持水性、粘稠性的特点，作为低热量食品添加剂，广泛应用于食品行业。研究表明，应用DDase是一条优良的右旋糖酐合成途径。该种产品还有许多潜在应用领域亟待开发，如新型食品添加剂、淀粉基甜味剂、低脂肪食物替代品等等。

近二十年来，人们开始慢慢关注这种特殊的转糖基酶，分别对该酶的特性进行了深入的研究，包括影响产酶的环境因素、酶的纯化、酶的底物特异性以及糖基衍生物的合成等等。但是，到目前为止，关于氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶分离纯化技术方法及其酶学性质的研究鲜有报道，而分子量小于100的小分子右旋糖酐糊精酶，更未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)胞内分离纯化的右旋糖酐糊精酶，及其制备方法和主要酶学性质，以弥补现有技术不足。

本发明的右旋糖酐糊精酶，是从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌中分离纯化得到的，其SDS-PAGE电泳分子量大小为62kD。

上述的氧化葡萄糖杆菌可以选用Gluconobacter oxydans DSM 2003菌。

上述的右旋糖酐糊精酶，其作用底物为麦芽糊精。

上述的右旋糖酐糊精酶，其抑制剂为Fe²⁺，Zn²⁺或Cu²⁺。

上述的右旋糖酐糊精酶，其最适酶反应pH范围为4-10。

上述的右旋糖酐糊精酶，其最适酶反应温度为15-55℃；温度稳定区间低于30℃；pH稳定区间为4.5-9.5；米氏常数K_m为0.63mmol/L；最大反应速率V_max为7.48μmol/(mL·min)。

上述的右旋糖酐糊精酶是联合应用离子交换层析和凝胶过滤层析法从氧化葡萄糖杆菌的发酵粗酶液中纯化得到的。

本发明的右旋糖酐糊精酶在制备右旋糖酐中的应用。

本发明的右旋糖酐糊精酶，其用麦芽糊精为底物所合成出的右旋糖酐与肠膜状明串珠菌所制备的右旋糖酐相比，只含有α-1，6-糖苷键和α-1，4-糖苷键，并且制备的右旋糖酐结构中出现了肠膜状明串珠菌右旋糖酐上是很少见的α-1，4-支链这一结构。除此之外，相比于G.oxydans ATCC 11894所合成的右旋糖酐，该酶所合成的右旋糖酐中支链的比例更高(12％)，并且具有粘度低的特点。这些特性将使其在食品领域拥有更广阔的应用前景。

附图说明

图1：本发明的右旋糖酐糊精酶纯化过程的电泳图；其中泳道1为粗酶液，2为膜过滤液，3为Q Sepharose Fast Flow溶液，4为ANX Sepharose Fast Flow溶液，5为Sephadex 75PG溶液，6为标准分子量蛋白(18.4、25、35、45、66.4、116kD)；

图2：本发明右旋糖酐糊精酶的凝胶渗透色谱图；