[发明专利]一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域，涉及一种基因工程中得以广泛使用的DNA分子量标准(DNA Marker)的生产方法。具体地，本发明涉及一种用于低成本快速生产高质量DNA Marker的质粒及其构建方法，同时涉及利用该质粒生产DNA Marker的方法与应用。 

背景技术

基因工程又称重组DNA技术，是指在体外在分子水平上对DNA进行切割、连接、修饰等一系列操作的过程，是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，诞生于20世纪70年代的一门崭新的生物科学技术。尽管该技术是一门年轻的技术，但其在生命科学、生物医学领域甚至是物理学、高分子科学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。 

在对DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的分离、纯化、切割、修饰、连接、扩增、序列测定等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA的电泳。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在支持介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备、检测、浓度测定、目的DNA片段的纯化，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。 

在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的长度)呈线性关系。因此，可以用一组分子量(长度)已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样 品的分子量的DNA片段混合物就称为DNA分子量标准，简称DNA Marker。 

DNA Marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现DNAMarker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前各实验室中DNA Marker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNA Marker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNAMarker产品。 

DNA Marker的制备上，目前主要有两种方法：PCR法和酶切法。 

PCR法实现简单，通过PCR(聚合酶链式反应)技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了DNA Marker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNAMarker。为了改善重复性和降低成本，目前的主流方法已经由获得单一的DNA片度PCR向多重PCR(多对引物针对同一模板或一对引物针对多个面板的情况)技术发展。但其仍然存在成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差等缺点。 

酶切法又分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列DNA片段组合。用该方法生产的最经典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌体基因组DNA经过内切酶Hind III消化后，产生125bp至23130bp大小的8条条带。用这种方法生产DNA Marker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显然易见的：1、条带距离不均匀，由于来自天然的基因组，DNA分子上的酶切位点的位置也是天然的，是不可控的，因此DNAMarker中有的两个条带之间相聚很远，不能清晰地指示该区域内的未知DNA分子量情况，有的两个条带之间距离很近，难以清晰地分开；2、基于同样的原因，条 带的分子量未能是整数；3、条带亮度严重不均一，这也是最严重的问题，由于对应片段在基因组中的拷贝数不可控，分子量大的条带的亮度与分子量较小的条带的亮度相差很远，以Lambda DNA/Hind III Marker为例，最大的条带23130bp与最小的条带125bp在亮度上要相差上百倍，电泳过程中往往导致大条带未实现良好分离而小条带已经严重扩散导致亮度很低甚至不可见。