[发明专利]一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途

权利要求书

1.一种用于DNA Marker制备的质粒，所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。

2.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点为II型限制性内切酶酶切位点。

3.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点选自Hind III、EcoR I、BamH I或Pst I的酶切位点。

4.如权利要求1-3任一所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小。

5.如权利要求4所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，组成目标DNAMarker的各大小不同的片段在该质粒中的拷贝数与该片段的长度有关，要达到同样信号强度，长度越小的片段在质粒中的拷贝数越高。

6.如权利要求5所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，某DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数与该DNA Marker片段长度的乘积，比上另一DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数与该另一DNA Marker片段长度的乘积获得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段与所述另一DNAMarker片段的信号强度比值。

7.如权利要求5所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的关系为：各DNA Marker片段拷贝数与片段长度的乘积一致。

8.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO：1。

9.一种用于DNA Marker制备的质粒的制备方法，包括下列步骤：

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点；

(2)确定用于质粒构建的同尾酶对，确定用于完全酶切法制备DNA Marker的所述单酶切位点对应的酶；

(3)选择高拷贝数质粒作为骨架载体并在其中引入所述同尾酶对中任意一个同尾酶的酶切位点和一个所述单酶切位点，构建完成的骨架载体中，所述同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一；

(4)制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，并分别连接到中间载体中获得各DNA Marker前体片段的中间载体，这些片段两端为所述同尾酶对的酶切位点，中间包含一个所述单酶切位点，各DNA Marker前体片段中所述单酶切位点离片段某一端的距离一致，且各DNA Marker前体片段中该端的同尾酶酶切位点相同，在构建完成的中间载体中，所述同尾酶对中任一同尾酶的酶切位点及所述单酶切位点均为唯一；

(5)将中间载体中的各DNA Marker前体片段依次连接起来，构建到步骤(3)制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述同尾酶对应的酶切位点应不同于所述单酶切位点。

11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)为：分别以步骤(4)获得的各DNA Marker前体片段的中间载体为起点，反复利用同尾酶酶切及拼接的方式获得含有各DNA Marker前体片段串联重复片段的中间载体，直至各DNA Marker前体片段的中间载体中，DNA Marker前体片段的拷贝数达到设计要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式，将含有符合设计DNA Marker前体片段拷贝数要求的各中间载体中的DNA Marker前体片段拼接入步骤3制备的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。