[发明专利]DNA重组酶Cre基因的改造、重组蛋白表达方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及Cre重组酶突变体的构建及在胰岛beta细胞标记中的应用。

背景技术

成年胰腺中存在一种自发的再生现象。研究发现，胰腺beta细胞在正常生理状态下，不断进行着低水平分裂和死亡。在一些特殊生理（如肥胖、妊娠、胰岛素阻抗）和病理（如胰腺损伤、毒素作用）压力下，胰腺细胞包括beta细胞都会有一定程度的再生。通过研究各种胰腺再生动物模型（如注射连脲霉素、胰管结扎、胰腺部分切除），一些观点认为新生的beta细胞由胰腺祖细胞分裂分化而来。这一结论与形态学上的研究相一致，许多新生的胰岛或胰岛素阳性细胞与胰管结构密切相关，因此，一部分胰管细胞有可能是腺祖细胞。然而，另外一些研究，利用可诱导的Cre-loxP系统，特异性地将beta细胞标记上碱性磷酸酶。这些谱系追踪研究表明新生beta细胞是从已有的beta细胞通过分裂而形成的。目前在新生beta细胞的来源及其再生机制上都有严重分歧，很大部分原因是目前的细胞标记技术可能存在一些缺陷，从而也就无法确定beta细胞再生的来源。

目前已建立了多种细胞标记与追踪技术，如荧光染料PKH26和Dil可以通过疏水作用插入到细胞膜的脂双层，实现对细胞膜的标记；核苷类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），可以插入分裂细胞的基因组，然后通过抗BrdU抗体加以检测；报告基因GFP、β半乳糖苷酶、荧光素酶等被广泛应用于细胞标记。为实现对细胞的永久性标记则需要改变基因组的结构，如利用慢病毒将报告基因插入染色体。目前最常见的是利用Cre-loxP系统进行永久性基因组DNA改变，并实现细胞的标记。

Cre是一种来源于噬菌体P1的重组酶，其名称来源于Causes of recombination，属于λ整合酶超基因家族。Cre基因的表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为38kDa，能对两个特异位点（loxP）之间的DNA序列进行重组。整合酶家族重组酶的共同特点是这些酶均由单个多肽构成，作用于核苷酸序列时，不需要其它辅助因子的参与，也不额外消耗能量。

LoxP（locus of X-over P1）序列来源于P1噬菌体，由两个13bp反向重复序列和8bp中间间隔序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：

5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC –TATACGAAGTTAT - 3'

　　3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'

两个LoxP之间的方向和位置可以决定重组后的三种结果：删除、翻转、或整合。如果两个Loxp位点同向且位于一条DNA链上，那么Cre重组酶将切除它们之间的序列；如果这两个Loxp位点反向位于一条DNA链上，它们之间的序列方向发生倒转；如果LoxP位点位于不同的DNA链，两条DNA链将通过LoxP位点进行整合。

    在胰腺发育研究中，Melton实验室采用基于Cre-loxP重组系统的转基因小鼠以标记胰岛beta细胞。这个系统需要构建两个品系转基因小鼠，一个携带了融合了突变型雌激素受体（ER）的重组酶CreER，由胰岛素启动子控制其表达，在没有诱导物时，重组酶定位在胞浆中，如加入Tamoxifen，CreER则进入细胞核；另一个品系携带由组成型启动子（CMV）控制的一段终止序列和报告基因，在终止序列前后有两个同向loxP位点。在无Cre酶存在的情况下，报告基因因终止序列的存在而不能表达。当两个品系的小鼠杂交，其后代小鼠的beta细胞表达重组酶CreER，在诱导物Tamoxifen的作用下，CreER进入细胞核，并切除两个loxP位点之间的终止序列，报告基因得以表达，实现beta的永久标记，即无论被标记的beta细胞表型如何变化，报告基因始终表达。Melton研究组利用该项技术发现，生理条件下及病理条件下新产生的beta细胞来自已有的beta细胞的分裂，而不是来自胰腺干细胞的分化。