[发明专利]ING4与OSM双基因共表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于腺病毒载体领域，具体涉及一种将ING4和OSM基因插入载体中形成重组载体并以此制备得到的腺病毒载体以及所得腺病毒载体的应用。

背景技术

现有技术中，从基因方面着手探讨喉癌发生、发展机制以及治疗方法成为了近年来癌症研究的重点方向之一。肿瘤基因治疗就是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其发挥特定的功能，继而执行对肿瘤的杀伤和抑制作用，或保护正常细胞免受化学治疗和放射治疗的损伤。自1990年Rosenberg等首次利用逆转录病毒载体基因转移技术治疗晚期癌症以来，肿瘤基因治疗有了突飞猛进的发展，越来越多的肿瘤基因治疗药物被批准进入临床试验，基因治疗有望在不久的将来成为肿瘤治疗的又一常规手段。为使众多目的基因具有更高的靶向性，杀伤性与稳定性，在载体选择方面，要从对基因表达的时间长短，靶细胞转导效率，可能产生的毒副作用等方面综合权衡。虽然腺病毒载体在体内应用时仍存在作用时间短等问题，但因其可以感染分裂和非分裂细胞、病毒滴度高、不整合到宿主染色体中、能够同时表达多种基因等优点而被广泛用于肿瘤的基因治疗中。由于肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多因素的复杂过程，涉及多种基因的异常，因而多基因联合治疗、从多个环节控制肿瘤的发生和发展往往显得更为合理。

ING4基因是近年来发现的ING（inhibitor of growth family，肿瘤生长抑制因子）家族成员之一，它由Shiseki等在2003年首次发现得到，后来被确定为一种重要的肿瘤生长抑制因子。ING4基因定位于人染色体12p13.3，大小约13kb，有8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长1380bp，编码248个氨基酸，其编码蛋白位于细胞核内，在人类正常组织中均有表达。ING4广泛参与基因转录的调控、细胞的增殖、凋亡和衰老、细胞接触抑制、血管生成抑制、DNA的损伤修复以及肿瘤转移侵袭的抑制。研究表明，ING4基因在多种肿瘤中易发生缺失突变或表达下调，并与肿瘤发生和肿瘤恶性程度密切相关。近年来，不少研究将ING4基因包装进腺病毒，通过腺病毒载体将ING4基因导入人类多种肿瘤细胞中，包括人肺腺癌细胞系A549、前列腺癌细胞、恶性黑色素瘤细胞系M14，结果显示，Ad-ING4感染的肿瘤细胞生长受到抑制，凋亡率明显高于感染空腺病毒载体的细胞组，可见ING4基因表达对肿瘤细胞有抑制生长、诱导凋亡的作用。Gunduz等研究发现ING4基因在头颈部鳞癌中表达有所下降，推断其在头颈部肿瘤中具有重要作用，但其功能与机制尚有待进一步研究。

OSM(oncostatin M)最初是由Zarling 等从U937组织型淋巴瘤细胞( histiocytic lymp homacells) 培养上清液中分离的一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的细胞因子，隶属于IL-6超家族，该家族成员包括IL-6，IL-11，LIF，ciliary neurotro-phic factor (CNTF)，cardiotropin-1 (CT-1)，novel neutrophin-1/B cell–stimulating  factor-3 (NNT-1/BSF-3 )等，他们由于受体结构类似（均含有 gp130 等基本亚单位）而具有相似的功能。由于OSM在结构、功能以及遗传性能上类似于leukemia inhibitory factor (LIF)，因此曾一度被认为是另一种LIF，但OSM亦具有很多独特的性能，包括抑制肿瘤细胞生长，刺激造血，炎症反应、促进巨噬细胞分化，对神经营养肽的诱导作用，调节胆固醇代谢以及对骨细胞的作用。人类抑瘤素M（hOSM）是一种耐热、耐酸的单链糖蛋白，其分子量为28000 ，基因定位于22号染色体q12上，cDNA编码252个氨基酸，它是一种能抑制肿瘤细胞增殖和促进正常成纤维细胞生长的多肽，已报道OSM对黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种实体瘤具有抑制作用，其作用机制可能与下述因素有关：与其受体结合后，通过JAK/STAT信号传导途径，作用于靶基因，如CDKIS的P21WAF1/CIPI，P27KLPI等，使细胞生长阻滞；通过下调癌基因如抑制如c-myc的表达而抑制细胞增殖；或通过免疫效应抑制细胞增殖。目前已经有不少研究利用腺病毒介导OSM基因来进行肿瘤基因治疗，如胰腺癌、肝癌、黑色素瘤。

如上所述，ING4是一种新型的肿瘤生长抑制因子，它主要在细胞内发挥抑瘤作用；OSM具有广谱的抑癌效应，主要在细胞外发挥作用；二者一旦发生基因缺失或突变常会导致多种肿瘤的发生。