[发明专利]一株适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株适合淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株及其应用，以及该类菌株的构建方法，属于工业微生物育种和乙醇发酵技术领域。

(二)背景技术

近年来，由于石油等化石能源日渐枯竭及汽车尾汽等环境问题的日益突出，世界各国越来越重视生物质可再生能源(醇类、氢气、碳氢化合物及生物柴油)的研究开发。自2005年开始，我国成为继美国和巴西之后的第三大燃料乙醇生产国家，根据《可再生能源中长期发展规划》和《可再生能源发展“十一五”规划》，到2020年我国生物燃料乙醇年利用量将达到1000万吨。

尽管燃料乙醇对缓解能源紧张和改善环境质量起到了积极的作用，但我国燃料乙醇生产应用过程中仍面临着诸多制约因素，主要集中在原料受到土地和水资源限制、生产过程能耗高及废料处理等难题。只有通过理论和技术创新，寻求高效清洁的生产工艺才能有效降低燃料乙醇的生产成本，提高其与化石能源的竞争力。针对我国燃料乙醇的生产现状，世界各国学者和工程技术人员普遍认为实现浓醪发酵，使酒精度达到15％(v/v)以上可极大地提高生产设备的利用率、减少工艺用水及降低乙醇蒸馏过程中的能耗，以提高燃料乙醇的社会经济效益。但是，与传统的发酵工艺相比，浓醪发酵对酿酒酵母菌株抗逆能力，特别是高渗和高乙醇浓度提出了更苛刻的要求。此外，由于浓醪发酵过程中酿酒酵母菌株会成生更多的副代谢产物(主要是甘油)来应激环境的胁迫。甘油的生成可消耗4％以上的糖，这无疑会严重降低糖醇转化率。因此，选育高抗逆性和乙醇转化率的酿酒酵母菌株成为了突破这项技术瓶颈的关键所在，这也是当前科学研究的一个热门课题。

酿酒酵母的环境耐受性是由多基因或基因网络调控下的复杂性状。对个别基因的操作很难实现大幅度改变菌株耐性。近几年的研究发明，相比传统的诱变，杂交和细胞融合等技术，全基因组重排技术在微生物菌株耐受性等复杂性状的改进方面具有明显的优势。它的原理是通过多轮的杂交或细胞融合使得亲株在全基因组范围内进行基因重排，使重组子积累有益突变，剔除有害位点，从而改进其性状。这项技术的不足之处是对控制菌株副代谢产物方面缺乏有效的筛选方法。相比之下，代谢工程技术能通过对某一代谢途径上的基因进行敲除或过表达从而能有效控制代谢产物的生成。通过敲除酿酒酵母甘油合成途径编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因GPD1和GPD2来实现甘油产量的降低就是一个重要的例子。但这样的基因操作往往会带来菌株生长能力或胁迫耐受性力下降的不利影响。例如，已有研究表明GPD1/2的敲除会使得酿酒酵母发酵速度减慢，原因是这两个基因对菌株的耐高渗能力和调节胞内氧化还原平衡起着重要作用。因此，很有必要发明一种能集成多种育种方法优势的新策略来构建适合浓醪发酵的酿酒酵母菌株。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株适于淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株及其应用，以及该类菌株的构建方法。

本发明采用的技术方案是：

一株适用于淀粉浓醪发酵乙醇的酿酒酵母菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZTS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 2011290，保藏日期：2011年8月16日。

该菌株由优良工业酿酒酵母菌株ZT12为出发菌株，先对其进行甘油-3-磷酸脱氢酶基因GPD2敲除获得低甘油产量的基因工程菌株ZΔGPD2，再对ZΔGPD2进行三轮的全基因组重排提高其抗逆性和弥补GPD2敲除对菌株的发酵的不利影响，从而获得环境胁迫耐受性强，浓醪乙醇发酵高产菌株ZTS3(MAT a/α；gpd2Δ::kanMX；gpd2Δ::bler)。

该菌株ZTS3适宜生长温度为28～40℃，最适生长温度为36℃，可耐受20％的乙醇。与出发菌株ZT12相比，ZTS3在高浓度乙醇、高温和氧化损伤耐受力上提高显著，乙醇产量提高6％左右，同时其副代谢产物甘油产量较亲株降低了8.5％左右，适于淀粉浓醪发酵。ZTS3和ZT12在多种抗逆相关生理生化因子的含量变化也进一步证实了ZTS3的性能优势和本发明中育种策略的有效性。

本发明还涉及所述的酿酒酵母CCTCC No：M 2011290在淀粉浓醪发酵制备乙醇中的应用。

乙醇的浓醪发酵，简单来说就是发酵过程中的高浓度发酵，具体表现在生产有以下特点：1、高酒份；2、高渗透压；3、高酵母数。就酒精生产而言，不同原料、不同时期浓醪发酵的界限存在着明显的差别；大概区分如下：淀粉质原料：酒精浓度在14～16％(V/V)，糖蜜原料：酒精浓度在10～12％(V/V)。