[发明专利]小分子化合物TWS119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用

说明书

技术领域

本发明所涉及的是再生医学和细胞生物学领域，具体涉及TWS119作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用。

背景技术

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)存在于胚胎和成年哺乳动物的中枢神经系统，具有自我更新和多向分化潜能，能分化为各种神经细胞，如神经元、少突胶质细胞以及星形胶质细胞等，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或遗传性代谢疾病、神经退行性疾病等提供了新的治疗策略。中枢神经系统损伤后，大部分NSCs分化为胶质细胞，在损伤部位形成胶质瘢痕，阻碍了轴突生长，使损伤不能修复。因此，提高NSCs向神经元的分化比例成为神经科学研究的热点。

目前，国内外通用的体外诱导NSCs增殖分化的方法是给予丝裂原，如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等，干预维持培养的神经干细胞，使其处于增殖状态，除去丝裂原并添加含胎牛血清的培养基后，诱导NSCs进行分化，但这种方法所得到的分化细胞主要是胶质细胞，神经元比例较低。

TWS119(3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-D]嘧啶-4-基]氧基]苯酚)是一种小分子有机化合物，最早是美国Scripps Research Institute的Wu等在2002年合成的[Wu，X.et al：J.Am.Chem.Soc.(2002)：124，14520-14521]。TWS119的结构式如下：

分子式：C₁₈H₁₄N₄O₂；分子量：318.3

Anand Mayasundari等人开发了TWS119的简易合成方法，通过与同时存在的普通环类原料在一个反应器中形成醚或硫醚连接，总共两步便可形成所需要的产物。简易合成步骤小结如下：

TWS119是糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)的抑制剂。GSK3β是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，受胰岛素、生长因子、细胞特异性因子和细胞黏着等细胞外刺激因素的抑制。GSK3β的活性调节细胞分裂、凋亡和炎症等细胞功能。当TWS119的IC₅₀值为30nM时，可抑制GSK3β的活性。但迄今为止，TWS119对哺乳动物NSCs的增殖与分化是否也有调控作用尚不明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供TWS119作为诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的诱导剂的新应用，从而为NSCs移植治疗神经系统疾病和损伤修复研究提供新的思路和方法。

本发明的目的之二在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培养基，含有诱导剂TWS119。

进一步，所述细胞培养基中含有浓度为200～500nM的诱导剂TWS119；

进一步，所述细胞培养基中含有浓度为350nM的诱导剂TWS119；

进一步，所述细胞培养基中还含有胎牛血清；

进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为5～20％的胎牛血清；

进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为10％的胎牛血清。

本发明的目的之三在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：

a.DMEM/F12基础培养液的制备：取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12(1∶1)干粉1袋、谷氨酰胺2.5g，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.35的磷酸盐缓冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节PH值为7.5，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，即得；

b.细胞培养基的制备：按照制备100ml细胞培养基计，将诱导剂TWS119(终浓度200～500nM)加入步骤a制得的DMEM/F12基础培养液70ml使溶解，用0.2uM微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清5～20ml、青霉素与链霉素的混合液(由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1∶1混合而成)1ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100ml。TWS119的终浓度为200～500nM。

进一步，所述步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM；

进一步，所述步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM，胎牛血清的加入量为10ml。