[发明专利]拟南芥脱水应答原件结合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种拟南芥(Arabidopsis thaliana)脱水应答原件结合蛋白及其编码基因与应用，具体涉及一个拟南芥中脱水应答原件结合蛋白2A基因(AtDREB2A)的克隆、重组及应用。

背景技术

植物总是直接生活在复杂多变的自然环境中。干旱、盐碱、寒冷及高温等逆境会使植物受到生理伤害，严重时甚至导致植物死亡。为了适应这些逆境，植物在漫长的的进化过程中演化出了对这些非生物胁迫的抗性机制，例如：气孔关闭、细胞膜及胞质成分的改变等。植物在非生物胁迫的作用下，能够通过信号传导途径，使一些基因的表达受逆境调控，从而对胁迫作出应答(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki，1996)。转录因子是一类能够特异地结合于特定DNA区，并对其下游基因的转录有激活或抑制作用的蛋白质。植物中的转录因子起着调控逆境胁迫应答，病原反应以及发育等相关基因表达的作用。其中的CBF/DREB(C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-binding)转录因子是植物非生物胁迫应答的重要成分，诱导表达后，可以激活许多下游抗逆基因的表达，从而增强植株的抗逆性。

自从1997年，Stocking等人用酵母一元杂交的方法从拟南芥中分离了一个DRE/CRT结合蛋白CBF1以来(Stockinger et al.1997)，已经到了许多DREB相关基因(DREB-like)，这些基因产物能够结合启动子区的DRE/CRT元件，以启动一序列非生物抗性基因的表达，并赋予植物耐盐、干旱、寒冷、高温等能力。(Gilmour et al.1998；Liu et al.1998；Shinwari et al.1998)。

一般认为，与植物抗病机制不同，植物对干旱和高盐等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技术导入单个功能基因很难大幅度地提高植物的抗逆性。而信号调控途径中的上游基因，如转录因子则能够基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合，在诱导下游抗逆相关的功能基因表达中起到关键作用，因此利用转录因子增强植物抗逆性成为改良植物抗逆性的重要途径。在抗盐基因工程领域，DREB-直备受关注，研究者们通过转基因手段DREB导入植物基因组中，得到了许多抗性增强的转基因品种。

DREB2A基因是DREB基因家族的成员，它的全cDNA序列与35S启动子相连转入拟南芥，发现在非胁迫条件下DREB2A能够表达，但下游基因表达微弱，植株抗性没有得到明显提高，推测DREB2A需要经过转录后加工比如磷酸化等。生物信息学分析表明，DREB2A蛋白的136-165位氨基酸残基富含泛素化位点，这些位点的存在，使得该蛋白进入降解途径，因而不能长期稳定存在，发挥功能。这也许是植物体内存在的对这个蛋白的负调控机制。在国内，周淼平等人将拟南芥DREB2A与bar基因同时导入小麦，测定了共转化频率，但并未对转基因小麦的抗盐性做出评估。我们通过折叠延伸PCR的方法将DREB2A中第136-165位氨基酸删除，得到组成型激活的DREB2A-CA。通过农杆菌介导的转基因方法，在转基因烟草中验证其功能。发现该基因能够有效地提高植物的抗盐，抗旱，抗高温能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥来源的脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活(constitutive activation/CA)基因(AtDREB2A-CA)。

本发明的第二个目的是提供该重组基因编码的蛋白质。

本发明的再一个目的还在于提供含有该重组基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供了一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供了一种上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供了一种上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)重组克隆载体pBS-T-AtDREB2A-CA。

含有上述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)的重组载体，这些重组载体包括质粒和植物表达载体。

所述的重组植物表达载体pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A-CA。